(1)樣品DNA的提取和定量按常規的方法提取DNA後,取部分樣品DNA在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳,與已知含量的Marker比較,用計算機凝膠成像分析係統處理結果,以確定所提取的DNA量。
(2)PCR反應及檢測包括:
①樣品DNA的質量分析:設計合適引物,對樣品基因組中的保守序列進行PCR擴增,確定獲得純化DNA的質量和模板量,同時判定PCR反應抑製因素的影響。
②建立內部參照反應體係:將高純度的pBI 121質粒(含兩個35S啟動子)與待測樣品DNA以同一對引物共擴增,消除假陰性現象的影響,分析擴增結果,得到可靠的半定量結果。
③測定CaM35S啟動子的PCR反應:為避免操作誤差,每個樣品PCR實驗重複三次,所用的DNA模板量為15~20ng。在對待測樣品PCR擴增的同時,進行空白對照、0.1%、0.5%、1%、2%、5%GMO含量的標準樣的PCR反應,根據凝膠電泳的結果建立工作曲線,由工作曲線判定待測樣品的GMO含量。
(二)定量競爭PCR法
先構建含有修飾過的內部標準DNA片段(競爭DNA),與待測DNA進行共擴增,因競爭DNA片段和待測DNA的大小不同,經瓊脂糖凝膠可將兩者分開,並可進行定量分析。一般流程如下:
(1)樣品DNA的提取和定量按常規方法提取DNA,DNA含量可用紫外分光光度計測定。
(2)競爭DNA的構建按常規分子生物學的方法,用基因重組技術構建競爭DNA片段作為內部標準DNA,此片段除含有轉基因成分外(如35S啟動子、Nos終止子),還插入數十個bp的DNA序列(或缺失數十個bp的DNA序列)。
(3)標準工作曲線的建立取定量模板DNA,所含GMO量分別為0~100%的係列參考樣,分別與定量的競爭DNA在同一反應體係進行PCR擴增。特異轉基因DNA與競爭DNA競爭反應體係中的相同底物、引物,PCR反應獲得相差數十個bp的兩條凝膠電泳帶,兩條帶濃度隨轉基因成分含量的不同而有差異。當兩條帶濃度相等,則說明此參考樣GMO濃度與競爭DNA濃度相等。通常實驗時競爭DNA濃度調整到與含1%轉基因成分的參考樣相當。通過凝膠成像分析係統對瓊脂糖凝膠電泳的結果進行分析,得到每條帶的相對濃度,以此數據作目標數圖,線性回歸分析後得出工作曲線圖。
(4)待測樣品的測定將500ng待測DNA與經過定量的競爭DNA共擴增,凝膠電泳後經掃描分析得到兩條帶,得到目標DNA競爭DNA的值,依此數據在工作曲線圖上求得待測樣品的GMO含量。
(三)實時定量PCR(Real-time PCR)法
此方法需設計一個內部探針,該探針包含5′端熒光報告因子和3′端淬滅因子。PCR反應前,由於淬滅因子與熒光報告因子的位置相近,使熒光受到抑製而檢測不到熒光信號。隨著PCR反應從上遊的PCR引物開始,引物和標記探針與目標DNA分子中對應的互補序列複性,聚合酶與探針相遇,利用其5′核酸外切酶活性使報告因子釋放,產生的熒光可被內設的激光器記錄,記錄到的熒光強度可反映PCR的產物量,從而實現實時定量分析。
此方法需要專門的儀器,如PE Applied Biosystems公司的A B I Prism 7700檢測儀,實驗中所需要的試劑供應商有試劑盒提供。
隨著PCR技術本身的不斷進步,可靠性不斷提高,以PCR技術為基礎的相關技術得到了很大的發展。如反相PCR(Inverse-PCR)、隨機擴增多態性DNA技術(RAPD),免疫PCR(lmmuno-PCR),不對稱PCR(Asymmetric PCR)、多重PCR(Multiple primer PCR)、固相PCR等。在關鍵技術上也有所進步,如熱循環儀在質量和技術上的發展;引物的設計可通過計算機和網絡來實現;已發展出多種具有各種不同特性的聚合酶體係和酶反應體係;目前已開發出了一係列的DNA聚合酶試劑盒,簡化了PCR操作,提高了實驗的重要性。相信PCR技術將在轉基因食品的檢測中大有可為。