根據核酸分子探針的來源及其性質可分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡核苷酸探針等。
一、基因組DNA探針
這類探針多采用分子克隆從基因文庫篩選或用PCR技術擴增製備。由於真核生物基因組中存在高度重複序列，製備探針應盡可能選用基因的編碼序列(外顯子)，避免選用內含子及其他非編碼序列，否則將引起非特異性雜交而出現假陽性結果。
二、cDNA探針
cDNA探針是以RNA為模板，在反轉錄酶的作用下合成的互補DNA，因此它不含有內含子及其他非編碼序列，是一種較理想的核酸探針。cDNA探針包括雙鏈cDNA探針和單鏈DNA探針。雙鏈cDNA探針的製備方法是首先從細胞內分離出mRNA，然後通過逆轉錄合成cDNA，再通過DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子。將雙鏈cDNA分子插入載體中克隆、篩選、擴增、純化，然後進行標記即可。單鏈DNA探針的製備相對來說要簡單些，即將cDNA導入M13衍生載體中，產生大量單鏈DNA，標記後即成。用單鏈DNA探針雜交，可克服雙鏈cDNA探針在雜交反應中的兩條鏈之間複性的缺點，使探針與靶mRNA結合的濃度提高，從而提高雜交反應的敏感性。
三、RNA探針
mRNA作為核酸分子雜交的探針是較為理想的，其優點是：①RNARNA和RNADNA雜交體的穩定性較DNADNA雜交體的穩定性高，因此雜交反應可以在更為嚴格的條件下進行(雜交溫度可提高10℃左右)，雜交的特異性更高；②單鏈RNA分子由於不存在互補雙鏈的競爭性結合，其與待測核酸序列雜交的效率較高；③RNA中不存在高度重複序列，因此非特異性雜交也較少；④雜交後可用RNase將未雜交的探針分子消化掉，從而使本底降低。但是，大多數mRNA中存在多聚腺苷酸尾，有時會影響其雜交的特異性，此缺點可以通過在雜交液中加入Poly(A)，將待測核酸序列中可能存在的Poly(dT)或Poly(U)封閉而加以克服。另外，RNA極易被環境中大量存在的核酸酶所降解，因此不易操作也是限製其廣泛應用的重要原因之一。事實上，極少使用真正的mRNA作為探針，因為其來源極不方便，一般是通過cDNA克隆，甚至基因克隆經體外轉錄而得到mRNA樣或anti-mRNA樣探針。
製備的RNA探針方法是，首先把目的基因cDNA片段插入到含有特異的RNA聚合酶啟動子序列的質粒中，再將重組質粒擴增、純化，用限製酶將質粒模板切割，使之線性化，然後在RNA酶的作用下，從啟動子部位開始，以cDNA為模板進行體外轉錄。在體外轉錄反應體係中，隻要提供有標記的核苷酸原料，經過體外轉錄後就能獲得標記的RNA探針。
四、寡核苷酸探針
采用人工合成的寡聚核苷酸片段作為分子雜交的探針，其優點是可根據需要隨心所欲地合成相應的序列，避免了天然核酸探針中存在的高度重複序列所帶來的不利影響；由於大多數寡核苷酸探針長度隻有15~30bp，其中即使有一個堿基不配對也會顯著影響其熔解溫度(tm)，因此它特別適合於基因點突變分析；此外，由於序列的複雜性降低，因此雜交所需時間也較短。需要注意的是，短寡核苷酸探針所帶的標記物較少，特別是非放射性標記時，其靈敏度較低，因此當用於單拷貝基因的Southern印跡雜交時，采用較長的探針為好。
寡核苷酸探針是以核苷酸為原料，通過DNA合成儀合成的。合成寡核苷酸探針的長度一般為10~50個核苷酸。如果靶DNA或mRNA的序列是已知的，合成寡核苷酸的序列就很容易確定。如果僅僅知道氨基酸的序列，由於遺傳密碼的兼並性，一個氨基酸兼有幾個密碼子編碼，如以氨基酸順序推測核苷酸順序，則可能與天然基因不完全一致，因此探針的設計就複雜得多。在確定寡核苷酸序列時，一定要使該探針與靶基因序列特異性結合，而與無關序列不產生雜交反應。目前有專門的計算機軟件幫助設計合成寡核苷酸探針，可用5′末端標記法、3′末端標記法或引物延伸法標記寡核苷酸探針。