②甘油：有報道，反應中加入5%~15%甘油有助於PCR反應的複性過程，尤其對G+C含量高和二級結構多的靶序列以及擴增長片段（＞1500bp）更適用，應注意的是，DMSO和甘油並非對所有PCR均有益，因此，是否加這些試劑應根據具體情況而定，也需要操作者的探索。
③氯化四甲基銨（TMAC）：在反應中加入1×10-5~1×10-4mol/L的TMAC可促進PCR去除非特異擴增，而不抑製Taq DNA聚合酶。
④T4噬菌體基因32蛋白質（gp32）：加入0.5~1.0μL的gp32 1nmol/L（Pharmacia公司），可使Taq聚合酶對長片段DNA的擴增改善至少10倍。
二、循環參數
（一）變性時間和溫度
模板DNA和PCR產物的變性不充分是PCR失敗的主要原因。DNA在其鏈分解溫度tss時的變性隻需幾秒鍾，但反應管內達到tss還需一定時間，變性溫度太高會影響酶活力。適宜的變性條件是95℃×30s，或97℃×15s，若低於94℃，則需延長變性時間。使用較高的溫度是適宜的，特別是對G+C比較豐富的模板序列。變性不完全，DNA雙鏈會很快複性，因而減少產量。在變性中，溫度太高或反應時間過長，又會導致酶活力的損失。為提高起始模板的變性效果，保存酶活力，常常在加入Taq酶之前97℃先變性7～10min，再按94℃的變性溫度進入循環方式，這對PCR的成功有益處。Taq DNA聚合酶活力半衰期在92.5℃為2h以上，95℃為40min，97℃為5min。
（二）引物的退火
退火溫度和所需時間取決於引物的堿基組成、長度和濃度。實際使用的退火溫度要低於擴增引物在PCR條件下真實tm值的5℃。引物越短(12~15bp)，退火溫度越低(40~45℃)。Taq DNA聚合酶的活性溫度範圍很寬，退火溫度在55~72℃之間會得到好的結果。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L），退火僅需數秒即完成。若降低複性溫度（37℃）可提高擴增產量，但引物與模板間錯配現象會增多，導致非特異性擴增上升；若提高複性溫度(56~70℃)雖擴增反應的特異性增加，但擴增效率下降。理想的方法是：設置一係列對照反應，以確定擴增反應的最適複性溫度。一些PCR的研究者建議PCR的擴增，使用兩種溫度範圍效果較好，55~75℃為退火和延伸溫度，94~97℃為變性溫度。
（三）引物的延伸
Taq DNA聚合酶雖能在較寬的溫度範圍內催化DNA的合成，但不合適的溫度仍可對擴增產物的特異性、產量造成影響。延伸溫度一般選擇在70~75℃之間（較複性溫度高10℃左右），此時Taq DNA聚合酶具有最高活力。
延伸時間長短取決於模板序列的長度和濃度以及延伸溫度的高低。在最適溫度下，核苷酸的摻入率為35～100nt/s，這也取決於緩衝體係、pH、鹽濃度和DNA模板的性質等，延伸1min對長達2kb的擴增片段是足夠的，延伸時間過長會導致非特異擴增帶的出現，但在循環的最後一步延伸時，為使反應完全，提高產量，可將延伸時間延長4~10min。如果底物的濃度非常低時，較長的擴增時間對初期的循環是十分有幫助的，在稍後的循環中，當擴增產物的濃度超過酶的濃度（約1μmol/L），dNTP減少，適當增加引物延伸時間對擴增有較好的幫助，所以最後一輪延伸時間常定為5~7min。
（四）循環次數
PCR的循環次數主要取決於模板DNA的濃度，一般為25～35次，此時PCR產物的積累即可達最大值，剛剛進入“平台期”。即使再增加循環次數，PCR產物量也不會再有明顯的增加。“平台期”是指PCR後期循環產物的對數積累趨於飽和，並伴隨0.3～1pmol靶序列的累計。隨著循環次數的增加，一方麵由於產物濃度過高，以致自身相結合而不與引物結合，或產物鏈纏結在一起，導致擴增效率的降低；另一方麵，隨著循環次數的增加，Taq DNA聚合酶活性下降，引物及dNTP濃度下降，易發生錯誤摻入，非特異性產物增加。因此，在得到足夠產物的前提下應盡量減少循環次數。