正文 PCR擴增產物的檢測分析(1 / 1)

目前檢測PCR擴增產物的方法包括凝膠電泳、層析技術、核酸探針雜交、酶切圖譜分析、單鏈構型多態性分析、核酸序列分析等。

一、瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是檢測PCR擴增產物最常用的方法之一。不同目的的電泳可使用各種濃度的凝膠。

核酸凝膠電泳結果的檢測方法有溴化乙錠染色、銀染色及同位素放射自顯影等,其中溴化乙錠染色法較為普遍。溴化乙錠(Ethidium Bromide,簡稱EB)是一種熒光劑,由於溴化乙錠分子插入在DNA雙螺旋結構的兩個堿基之間後,能形成一種在紫外光激發下發出很強橙紅色熒光的絡合物,所以十分容易觀察。檢測的靈敏度非常高,1μg/mL的溴化乙錠溶液可檢出10ng或更少的DNA樣品。演化乙錠產生的熒光在紫外光源下放置時間過長能被淬滅,也容易受一些化學物質的汙染而淬滅。溴化乙錠是一種DNA誘變劑,使用時應注意避免與皮膚接觸。實驗室中的EB汙染物應妥善處理,EB溶液的汙染物不能直接倒入下水道及垃圾中,含有EB的凝膠應在幹燥後燒毀。

用瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA片段的分子質量,是在同一塊凝膠板上樣品槽中加待測樣品,加一個標準分子量樣品同時進行電泳,然後用溴化乙錠染色,通過生物凝膠成像分析係統或紫外燈比較樣品與標準品的位置,即可估計出待測樣品的分子量大小範圍。實驗室常用的DNA分子量標準隻有pBR322和λDNA的酶切片段。

二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰膠凝膠電泳具有瓊脂糖凝膠電泳所不具備的優點:①分辨率很強,長度僅相差0.2(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分開;②能裝載的DNA量遠大於瓊脂糖凝膠,一個加樣槽(1cm×1cm)中加入10μg DNA也不會明顯影響分辨率;③從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高。另外,可以采用銀染色法染聚丙烯酰胺凝膠中的DNA和RNA,其靈敏度比溴化乙錠染色法高2~5倍,而且避免溴化乙錠迅速退色的弱點,銀染的凝膠幹燥後可長期保存。PCR擴增指紋圖,多重PCR擴增,PCR產物的酶切分析及利用產物的限製性片段長度多態性(PCR-RFLP)進行基因分型時,聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種理想的手段。不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠。

三、核酸探針雜交鑒定法

為了確定PCR產物是否是預先設計的目的片段,或產物是否有突變,都需做分子雜交檢測。分子雜交包括點雜交和Southern印跡雜交。點雜交無需進行電泳,直接對產物進行分析鑒定,還可將樣品稀釋成一係列不同濃度,對擴增產物進行定量分析。該法靈敏度較高,特別適用於特異性不高的PCR擴增產物分析。其基本過程是將擴增產物固定到尼龍膜或硝酸纖維素膜上,用放射性或非放射性標記的探針雜交,還可將不同的探針固定到膜上,用標記的擴增產物進行雜交,稱為“反向點雜交法”,該法可同時檢測多個突變位點或多種病原體。目前主要用寡核苷酸探針雜交(ASO)檢測點突變。

采用常規的Southern印跡雜交可鑒定PCR產物的大小和特異性,檢測靈敏度可達10ng。基本過程是PCR產物進行常規的瓊脂糖凝膠電泳,然後印跡轉移到尼龍膜上,再用標記的探針進行雜交檢測。

四、限製性內切酶分析

酶切分析是鑒別PCR擴增產物特異性的一種簡便方法。根據目標基因的已知序列資料可以查出包含的酶切位點,用某種限製性內切酶消化擴增產物後進行電泳,觀察消化片段的數目及大小是否與序列資料相符,從而確定產物的特異性。酶切分析的另一種用途是遺傳病的診斷和傳染病病原體的基因分型。酶切位點的改變是序列差異的遺傳路標,因此可利用高頻率切點的限製酶消化PCR擴增產物,根據限製性片段長度多態性(RFLP)進行目標基因分析和分型。

特異性鑒別可選用識別6個堿基的限製性內切酶,從已知序列資料中查出。基因分型可用識別4個堿基的限製性內切酶,常用的有AluⅠ,MspⅠ,TaqⅠ,HinfⅠ,MboⅠ,DdeⅠ,MseⅠ,BbuⅠ,MaeⅠ,MaeⅢ,Fnu 4HI,HhaⅠ,RsaⅠ等。

五、PCR擴增產物的直接測序

PCR技術在進行分子克隆和模板製備的大部分工作中顯示了極大的優勢,它不僅省略了通常製備DNA片段的繁瑣步驟,也避免了使用亞克隆的經典程序。結合自動化測序技術,PCR將為了解核苷酸序列信息提供最快和最有效的手段。直接序列分析是指在PCR擴增基因組DNA序列的基礎上,直接進行基因核苷酸序列分析的方法,是檢測基因突變最有效、最直接的方法。用於直接序列分析的方法主要有化學降解法、Taq DNA聚合酶測序法、三引物法、不對稱PCR法等。