葛根芩連方中多成分腸滲透性的原藥材歸屬研究
中藥生物藥劑學分類係統專題
作者：朱美玲 楊文寧 董玲 董紅環 侯成波 劉洋
[摘要] 中藥生物藥劑學分類係統（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）構建的複雜層麵為中藥複方研究，在堅持多成分同時測定的前提下，開展滲透性研究時，其首要任務是明確透過腸壁而被吸收的成分來源，即具體歸屬於中藥複方中的哪味藥材。該研究利用化學成分指紋圖譜技術（chemical fingerprint），采用離體翻轉腸囊實驗技術對經典名方葛根芩連方中的腸滲透多成分進行直觀來源歸屬，為下一步的腸滲透性定性及定量研究奠定基礎。
[關鍵詞] 中藥生物藥劑學分類係統；葛根芩連方；滲透性；離體翻轉腸囊；多成分；化學成分指紋圖譜
[收稿日期] 2014-07-18
[基金項目] 國家自然科學基金項目（81473362）；北京中醫藥大學創新團隊發展計劃項目（2011-CXTD-13）
[通信作者] *董玲，副研究員，碩士生導師，主要從事新劑型給藥係統研究，Tel：（010）64286245，E-mail；*劉洋，副教授，碩士生導師， 主要從事藥物代謝研究，Tel：（010）84738629，E-mail
[作者簡介] 朱美玲，碩士研究生，E-mail
中藥生物藥劑學分類係統的分類依據中，滲透性是重要指標之一，但因中藥成分的複雜性，尤其是中藥複方，需按照腸滲透成分歸屬、腸滲透成分定性和腸滲透成分定量分析的過程，逐步闡述。為堅持中藥多成分整體性研究的原則，利用化學成分指紋圖譜技術，運用單味藥材和複方交叉對比的方法，開展腸滲透多成分的原藥材歸屬研究是可行的。腸滲透性實驗方法很多，通過前期的實驗方法研究，因離體外翻腸囊法的多成分指紋圖譜直觀性最優，而被選中。該方法最初是由Wilson和Wiseman於1954年創建[1]，具有直接、快速反映吸收行為，可控、簡便調整實驗條件的優勢，雖定量準確性稍差，但卻是研究鎖定吸收成分的有效手段。葛根芩連方是源於《傷寒論》的經典名方，由葛根、甘草、黃芩和黃連組成。目前對於其藥效成分和質量控製具有廣泛而深入的研究報道[2-3]，但對於其整體的多成分腸滲透性卻未見文獻報道。因此本研究對葛根芩連方進行實驗，探索其組方各味藥材的主要成分在葛根芩連方的多成分環境下，是否可以被吸收，從而為下一步的多成分腸滲透性定性和定量分析提供基礎支撐。
1 材料
1.1 儀器
Waters液相色譜係統（600四元泵，美國Waters公司）；2487雙波長紫外檢測器，Empower2工作站；電子分析天平（BT-25S，北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-4，北京中興偉業儀器有限公司）。
1.2 藥物
葛根、黃芩、黃連及甘草購買於北京同仁堂藥店；葛根素對照品（批號110752-200912，中國食品藥品檢定研究院）；葛根素原料（批號120504，陝西中鑫生物技術有限公司）；黃芩苷原料（批號ZL-A-018，南京澤朗醫藥科技有限公司）；鹽酸小檗堿原料（批號120212，陝西中鑫生物技術有限公司）；甘草酸單銨原料（批號GU20120611，武漢金諾化工有限公司）。
1.3 試劑
乙腈購買於美國Fisher公司（色譜級）；乙酸、三乙胺、磷酸、氯化鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、葡萄糖購買於北京化工廠（分析級）；娃哈哈純淨水購買於娃哈哈集團公司（中國杭州）。
1.4 動物
Wistar大鼠，雄性，體重200～250 g，北京維通利華試驗動物技術有限公司提供，許可證號 SCXK（京）2012-0001。
2 方法
2.1 葛根芩連方多成分色譜指紋圖譜分析方法的建立
采用高效液相色譜法測定，參照相關文獻[4]，色譜條件為：Thermo Scientific，Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm；柱溫室溫；進樣量10 μL；緩衝溶液（1%三乙胺，1%乙酸，用磷酸調pH到3.0，A）-甲醇（B）進行梯度洗脫（0～12 min，76%A；12～13 min，76%～72%A；13～19 min，72%A；19～20 min，72%～66.2%A；20～37.5 min，66.2%A；37.5～38.5 min，66.2%～59%A；38.5～60 min，59%～25%A）。
2.2 葛根芩連方及其組方藥材的離體翻轉腸囊法多成分吸收定性研究
2.2.1 人工腸液的製備 稱取葡萄糖0.7 g，氯化鎂0.01 g，磷酸二氫鈉0.16 g，氯化鈉3.9 g，氯化鉀0.175 g，氯化鈣0.185 g，碳酸氫鈉0.685 g，用蒸餾水定容於500 mL量瓶中，備用。
2.2.2 腸吸收藥液的製備 稱取複方中的各味藥材研成粉末（全部過20目篩），取適量用50%甲醇超聲提取1 h，時時振搖，將提取液濃縮至無甲醇味，加人工腸液製成一定濃度藥液，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液供HPLC分析。
2.2.3 大鼠離體翻轉腸囊模型實驗方法 采用禁食不禁水12 h的健康大鼠，水合氯醛麻醉，小心將腸管同腸係膜剝離，分別取小腸10 cm，放入37 ℃的人工腸液中，衝洗至無內容物流出。小心剝離腸段表麵的腸係膜和脂肪，將腸管一端結紮於自製塑料套管，小心將腸管翻轉，向腸囊內注入1 mL空白人工腸液，結紮另一端，放入37 ℃恒溫的藥液中，通入氧氣。孵育1 h後將腸囊取出，擦淨表麵液體，傾出液體。過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液供HPLC分析。