【注意事項】
（1）在呈色反應中，2，4-二硝基苯肼與帶有酮基的化合物反應時形成苯腙。底物中的α——酮戊二酸可以與2，4-二硝基苯肼反應，生成α——酮戊二酸苯腙。因此在製備標準曲線的時候需要加入一定量的底物以抵消α——酮戊二酸的影響。
（2）嚴格按照實驗步驟進行，溫度和時間均要嚴格控製。
【思考題】
（1）簡單描述穀丙轉氨酶活力測定的原理和操作步驟以及注意事項。
（2）測定血清中的穀丙轉氨酶活力有什麼生物學意義。
實驗三十：蛋清溶菌酶的製備及活力測定
【實驗目的】
（1）熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。
（2）掌握溶菌酶的提取及活力測定方法。
【實驗原理】
溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種堿性糖苷水解酶，能作用於細菌細胞壁的黏多糖，具有殺菌等作用，廣泛應用於醫學臨床。
溶菌酶存在於植物漿及動物（蛋清、血漿、淋巴液和鼻黏膜等處）組織中，其中雞蛋清中含量較為豐富，且雞蛋清取材方便，因此實驗室及實際生產中一般以雞蛋清為原料進行溶菌酶的提取製備。
從雞蛋清中分離溶菌酶可以選用多種不同的方法和步驟。本實驗采用的分離純化步驟為：等電點及熱變性選擇性沉澱→聚丙烯酸處理→葡聚糖凝膠柱層析→聚乙二醇濃縮。溶菌酶具有耐熱性，在酸性條件下經受長時間高溫處理而不喪失活性；而且溶菌酶又具有特別高的等電點，因此采用熱變性與等電點沉澱相結合的方法可除去大部分的雜蛋白。聚丙烯酸是一種多聚電解質，在酸性條件下可以與溶菌酶結合形成凝聚物；當有鈣離子存在時溶菌酶又能從這種凝聚物中分離出來，同時生成丙烯酸鈣沉澱，後者經過硫酸的酸化又重新形成聚丙烯酸。在實驗中，一旦提取液中溶菌酶與聚丙烯酸結合，所形成的凝聚物會立即黏附於試管的底部，傾去上層液體可使溶菌酶既得到純化，又得到濃縮。最後再用葡聚糖凝膠柱層析，使雜蛋白、溶菌酶和鈣離子分開。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）Sephadex G-50。
（2）1％NaCl-0.05mol／LHCl。
（3）20％HAc。
（4）10％聚丙烯酸（現配現用）。
（5）0.5mol／LNa2CO3。
（6）500g／LCaCl2。
（7）NaCl。
（8）6g／LNaCl。
（9）飽和草酸溶液。
（10）細菌懸液：取1g豔紅K-2BP標記的微球菌Mlysodeikticus懸於100mL0.5mol／L的pH6.5磷酸緩衝液中，置於冰箱內保存備用。
（11）乳化劑：2gBrij-35（聚氧乙烯脂肪醇醚）加50mL蒸餾水微熱使溶解，冷卻後定容至100mL。吸取此液10mL用0.6mol／LHCl定容至200mL備用。
（12）0.5mol／L的pH6.5磷酸緩衝液。
（13）溶菌酶標準品：優級純。
2.器材
玻璃層析柱（2.5cm×34cm）、電熱恒溫水浴鍋、離心沉澱機、10μL微量進樣器、721型分光光度計。
3.材料
雞蛋。
【實驗操作】
1.蛋清溶菌酶的分離提取
（1）變性與等電點選擇性沉澱：取新鮮蛋清用1％NaCl-0.05mol／LHCl溶液攪拌稀釋，加20％HAc調至pH4.6，3000r／min離心10min，收集濾液並記錄體積，留樣2mL（Ⅰ）待分析。將濾液置於沸水浴中使3min內迅速升溫至75℃，用流動水速冷後，3000r／min離心20min，收集上清液，記錄體積，並留樣2mL（Ⅱ）待分析。
（2）聚丙烯酸處理：在所得上清液（pH6.0左右）中滴加10％聚丙烯酸（用量為清液體積的1／4），慢速攪拌，當凝聚物出現後，靜置30min使凝聚物黏附於容器底部。傾去上清液，加入蒸餾水約1mL，並滴加少量0.5mol／LNa2CO3，使沉澱溶解，此時溶液pH6.0左右。攪拌條件下向溶液中滴加500g／LCaCl2（體積為聚丙烯酸量的1／12.5），生成的沉澱擠壓幹後棄去。如所得溶液不夠澄清，可以進行離心或簡單過濾，並用少量水洗滌濾紙。收集濾液於刻度試管，記錄體積，留樣0.5mL（Ⅲ）待分析。
（3）Sephadex G-50柱層析
①裝柱：稱取15gSephadex G-50，加入300mL蒸餾水溶脹6小時以上，置熱水浴中加熱除去氣泡，冷卻後裝入玻璃層析柱。用6g／LNaCl溶液200mL平衡層析柱。
②上樣：向樣液中加入固體NaCl使終濃度為50g／L，上樣時先吸去層析柱凝膠麵上的溶液，再沿管壁滴加樣品，樣品量不宜超過10mL。加完後打開層析柱出口，讓樣品均勻流入凝膠內。
③洗脫：樣品流完後，先分次加入少量6g／LNaCl洗脫液衝洗柱壁上的樣品，然後接通蠕動泵，繼續以6g／LNaCl洗脫，調節操作壓力使流速控製在7～8mL／10min，部分收集器收集，10min收集一管，共收集200mL左右。
④分析：記錄各管體積，紫外光吸收法測定各管中蛋白質濃度。合並含有蛋白質的收集管，草酸鑒定Ca2+，留樣（IV）待分析。
2.乙二醇濃縮
將洗脫液放入透析袋，外麵裹以聚乙二醇，置於加蓋容器中。當酶液水分被聚乙二醇吸收而濃縮至5mL左右時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出濃縮液，記錄體積，留樣0.5mL（Ⅴ）待分析。
3.溶菌酶活力測定
取上述各待測酶液稀釋30～50倍，進行酶活力測定。
用微量進樣器取酶液樣品10μL，加入0.5mLpH6.5的0.5mol／L磷酸緩衝液（相當於稀釋50倍），混合均勻，37℃預熱2min，然後加入同樣已預熱過的細菌懸液0.5mL。37℃保溫反應15min後，用2mL乳化劑停止反應。反應液經3000r／min離心10min，取上清液在721型分光光度計上進行比色（540nm）。空白管用磷酸緩衝液替代樣液，其他操作同樣品。
【思考題】
（1）溶菌酶有何重要性質，可應用在哪些領域？
（2）溶菌酶殺菌的機理是什麼？
實驗三十一：堿性磷酸酶的分離與純化
【實驗目的】
（1）掌握酶分離純化的一般步驟及相關原理。
（2）熟悉堿性磷酸酶分離純化的方法步驟。
【實驗原理】
有機溶劑分級沉澱是分離蛋白質的常用方法之一。有機溶劑能使許多溶於水的生物大分子發生沉澱，其主要作用是降低水溶液的介電常數。例如20℃時水的介電常數為80，82％的乙醇溶液的介電常數40。溶液的介電常數降低意味著溶質分子間異性電荷庫侖引力增加，從而使溶質的溶解度降低。同時有機溶劑溶於水，對大分子物質表麵的水化膜具有破壞作用，使這些大分子脫水而互相聚集析出。沉澱不同物質所需有機溶劑的濃度不同，利用不同蛋白質沉澱時所需有機溶劑濃度不同可將它們分離。
用於生物大分子分級分離的溶劑主要是能與水互溶的有機溶劑，常用的有乙醇、甲醇和丙酮等。進行有機溶劑沉澱時，欲使原溶液中有機溶劑達到一定濃度，需加入有機溶劑的濃度和體積可按下式計算：
V=V0（S2-S1）（100-S2）
式中V——需加100％有機溶劑劑的體積；
V0——原溶液的體積；
S1——原溶液中有機溶劑的濃度；
S2——要求達到的有機溶劑濃度；
100——指加入的有機溶劑濃度為100％。如所加入的有機溶劑的濃度為95％，上式（100-S2）項應改為（95-S2）。
在大規模製備沉澱時，若溶劑濃度的要求不太嚴格時，可用簡單的交叉方法求出。
本實驗采用有機溶劑沉澱法從肝勻漿中分離純化堿性磷酸酶（簡稱AKP）。先用低濃度醋酸鈉（低滲破膜作用）製備肝勻漿，醋酸鎂則有保護和穩定AKP的作用。勻漿中加入正丁醇可使部分雜蛋白變性，釋出膜中酶，過濾，以去除雜蛋白。含有AKP的濾液用冷丙酮和冷乙酸進行重複分離純化。根據AKP在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙醇中不溶解的性質，用冷丙酮和冷乙醇重複分離提取，可從含有AKP的濾液中獲得較為純淨的堿性磷酸酶。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）0.5mol／L醋酸鎂溶液：107.25g醋酸鎂溶於蒸餾水中，定容至1000mL。
（2）0.1mol／L醋酸鈉溶液：8.2g醋酸鈉溶於蒸餾水中，定容至1000mL。
（3）0.0lmol／L醋酸鎂——0.01mol／L醋酸鈉溶液：準確吸取20ml0.5mol／L醋酸鎂溶液及100mL0.1mol／L醋酸鈉溶液，混勻後定容至1000mL。
（4）Tris-HClpH8.8緩衝液：稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g，用蒸餾水溶解後定容至1000mL，即為0.1mol／LTris溶液。取100ml0.1mol／LTris溶液，加蒸餾水約780mL，再加0.1mol／L醋酸鎂溶液100mL，混勻後用1％冰醋酸調pH為8.8，用蒸餾水定容至1000mL。
（5）正丁醇、丙酮、95％乙醇，均為分析純試劑。
2.器材
移液管、量筒、玻璃勻漿器（管）、剪刀、離心機、定性濾紙。
3.材料
新鮮兔肝。
【實驗操作】
以下操作均在4～10℃進行。
1.A液製備
稱取新鮮兔肝2g，剪碎後，置於玻璃勻漿器中，加入2.0mL0.01mol／L醋酸鎂——0.01mol／L醋酸鈉溶液，充分磨成勻漿後，將勻漿液轉移至離心管中，用4.0mL上述溶液分兩次衝洗勻漿管，並倒入離心管中，混勻，此為A液。另取1支試管，編號為A，取0.1mLA液，加入4.9mLTris緩衝液（pH8.8），混勻，供測酶活性用。
2.B液製備
（1）加2.0mL正丁醇溶液於上述剩餘的勻漿液中，用玻璃棒充分攪拌2min左右。然後在室內放置20min後，濾紙過濾，濾液置離心管中。
（2）於濾液中加入等體積冷丙酮，立即混勻後離心5min（2000r／min），棄上清液，向沉澱中加入4.0mL0.5mol／L醋酸鎂溶液，用玻璃棒充分攪拌使其溶解，同時記錄懸液體積，此為B液。吸取0.1mLB液，置於編號為B的試管中，加入4.9mLTris緩衝液（pH8.8），供測酶活力用。
3.C液製備
（1）取剩餘懸液體積，並計算使乙醇終濃度為30％需要加入的95％冷乙醇量。按計算量加入乙醇，混勻，立即離心5min（2000r／min），量取上清液體積。倒入另一離心管中，棄去沉澱。向上清液中加入95％冷乙醇，使乙醇終濃度達60％（計算方法同前），混勻後立即離心5min（2500r／min），棄上清。向沉澱中加入4.0ml0.01mol／L醋酸鎂——0.01mol／L醋酸鈉溶液，充分攪拌，使其溶解。
（2）重複操作上一步驟，向懸浮液中加入冷乙醇（95％），使乙醇終濃度達30％，混勻後立即離心5min（2000r／min），計算上清液體積，倒入另一離心管中，棄去沉澱，向上清液中加入95％的冷乙醇，使乙醇終濃度達60％。混勻後，立即離心5min（2500r／min），棄上清液，沉澱用3mL0.5mol／L醋酸鎂溶液充分溶解，記錄體積，此為C液。吸取C液0.2mL置於編號為C的試管中，加入3.8mLTris緩衝液（pH8.8），供測酶活性用。
4.D液製備
向上述剩餘懸液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮終濃度達33％，混勻後離心5min（2000r／min），棄去沉澱。量取上清液體積後轉移至另一離心管中，再緩緩加入冷丙酮，使丙酮終濃度達50％，混勻後立即離心15min（4000r／min），棄上清液，沉澱為部分純化的堿性磷酸酶。向此沉澱中加入4.0mLTrispH8.8緩衝液，使沉澱溶解，再離心5min（2000r／min），將上清液倒入試管中，記錄體積、棄去沉澱。上清液即為部分純化的酶液，此為D液。吸取0.2mLD液置於編號為D的試管中，加入0.8mLTris緩衝液（pH8.8），供測酶活性用。
【結果處理】
通過以上分離純化，可得到高活性的堿性磷酸酶樣品。
【注意事項】
用有機溶劑分離純化酶（或蛋白質）必須注意以下幾點：
（1）有機溶劑沉澱是個放熱過程，所以要在低溫下進行。溶劑應預冷，加入時要邊攪拌邊滴加，以避免局部濃度過高使酶蛋白變性。
（2）溶劑的pH最好控製在被分離物質的等電點附近，以提高被分離物質的分離效果。蛋白質濃度應控製在5～20mg／mL，以防止高濃度樣品的共沉澱作用。
（3）溶液的離子強度控製在0.05～0.1範圍內。
（4）有機溶劑中有中性鹽存在時能增加蛋白質的溶解度，減少變性，提高分離效果。中性鹽濃度一般以0.05mol／L左右為好，過高影響沉澱。
【思考題】
（1）分離純化堿性磷酸酶是利用堿性磷酸酶的哪些特性？
（2）在堿性磷酸酶的分離純化過程中應注意哪些環節？
實驗三十二：澱粉酶的活力及比活力測定
【實驗目的】
（1）掌握澱粉酶活性測定的原理。
（2）學習澱粉酶活力測定的方法。
（3）鞏固並熟練分光光度計的使用。
【實驗原理】
澱粉酶廣泛存在於動物、植物和微生物界，不同來源的澱粉酶，性質有所不同。根據澱粉酶對澱粉的作用方式不同，澱粉酶可分為四種主要類型：即α——澱粉酶、β——澱粉酶、葡萄糖澱粉酶和異澱粉酶。其中植物中以禾穀類種子的澱粉酶活性較強，小麥、水稻萌發時澱粉酶活性最強，此時澱粉酶活性大小與種子萌發力有關。
澱粉酶能使澱粉水解成麥芽糖，由於麥芽糖能將3，5-二硝基水楊酸試劑還原成橙紅色的3-氨基——5-硝基水楊酸，且在一定範圍內還原糖的濃度與反應液的顏色呈正比，故利用比色法可求出麥芽糖的含量。以5min內每1g樣品水解產生麥芽糖的質量（mg）表示酶活力的大小。
植物澱粉酶可分為α——澱粉酶、β——澱粉酶兩種，其中β——澱粉酶不耐熱，在溫度70℃以上易鈍化；而α——澱粉酶不耐酸，在pH3.6以下則發生鈍化。根據以上特性，可分別測定這兩種澱粉酶的活力。如測定α——澱粉酶和β——澱粉酶的活力，即為澱粉酶總活力。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）石英砂。
（2）1％澱粉溶液：稱1g可溶性澱粉，加入100mL蒸餾水，煮沸（臨用時配製）。
（3）pH5.6檸檬酸緩衝液液：稱取檸檬酸21g，溶解後定容到1000mL；B液：稱取檸檬酸鈉29.4g，溶解後定容到1000mL。量取A液55mL與B液145mL混勻，即為pH5.6的緩衝液。
（4）0.4mol／L的NaOH溶液。
（5）3，5-二硝基水楊酸試劑：取1g3，5-二硝基水楊酸，溶於20ml2mol／LNaOH中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解後，用蒸餾水稀釋至100mL，蓋緊瓶蓋，勿使二氧化碳進入。
（6）麥芽糖標準溶液：稱取0.1g麥芽糖，溶於少量蒸餾水中，然後定容到100mL，即為1mg／mL麥芽糖標準液。