2.器材
20mL具塞試管、移液管、100mL容量瓶、研缽、721分光光度計、恒溫水浴鍋、離心管等。
3.材料
萌發3～4天的水稻或小麥種子。
【實驗操作】
1.酶液的製備
稱取萌發小麥種子，置研缽中，加0.5g石英砂研磨成勻漿，用8mL蒸餾水分次洗滌研缽，將勻漿轉入離心管中，攪拌均勻後放置15～20min（間隔攪拌2～3次）。3500r／min離心10min，將上清液轉入25mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，得粗酶液。
2.α——澱粉酶與β——澱粉酶的酶促反應：
取4支10mL具塞試管，編號，按下麵加入各液。各管混勻後，置40℃水浴準確保溫5min，取出後立即向3、4號試管中分別加入4mL0.4mol／LNaOH終止酶活力。
管號：1（對照）、2（對照）、3（反應）、4（反應）
粗酶液／mL：1、1、1、1
pH5.6緩衝液／mL：1、1、1、1
40℃水浴保溫5min
0.4mol／LNaOH溶液／mL：4、4、0、0
預熱1％澱粉溶液／mL：2、2、2、2
3.麥芽糖酶測定
（1）標準曲線製作取20mL刻度試管7支，編號，分別加入1mg／mL麥芽糖標準溶液0、0.2、0.6、1、1.4、1.8和2mL。然後各管加蒸餾水，使體積為2mL，再向各管加3，5-二硝基水楊酸試劑2mL，置沸水浴中煮沸5min，取出後在自來水裏冷卻，用蒸餾水稀釋至20mL，搖勻後在520nm波長下用分光光度計比色，以光密度值為縱坐標，麥芽糖含量為橫坐標繪製標準曲線。
（2）樣品的測定取以上酶作用後的反應液及對照管中的溶液各2mL，分別放入20mL具塞刻度試管中，加入2mL3，5-二硝基水楊酸試劑，置沸水浴中準確煮沸5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至20mL，搖勻後在520nm波長下用分光光度計比色，記錄OD值，從麥芽糖曲線中查出相應麥芽糖含量，進行結果計算。
【結果處理】
澱粉酶總活力=（A-A′）×酶提取液總體積×酶反應稀釋倍數樣品質量（g）×顯色所用樣品液體積
式中A——酶反應管中麥芽糖含量，即3號和4號管中麥芽糖質量（mg）的平均值。
A′——對照管中麥芽糖含量，即1號和2號管中麥芽糖質量（mg）的平均值
【注意事項】
（1）試驗前應將所有研缽、試管、容量瓶等玻璃器皿衝洗幹淨，移液管分別使用，以避免酶遇強堿失活。
（2）注意控製好酶反應溫度及pH。
【思考題】
（1）簡述澱粉酶活力測定的原理。
（2）測定澱粉酶活力應注意什麼問題？
實驗三十三：蛋白酶活力測定
【實驗目的】
（1）了解測定蛋白酶活力的意義和實驗原理。
（2）熟練掌握測定蛋白酶活力的實驗方法。
【實驗原理】
蛋白酶在一定的溫度與pH條件下水解酪素底物，產生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在堿性條件下，將福林試劑還原，生成鉬藍和鎢藍，用分光光度法測定，計算其酶活力。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）福林試劑的製備：於2000mL磨口回流裝置中加入鎢酸鈉100g、鉬酸鈉25g、水700mL、85％磷酸50mL、濃鹽酸100mL、小火沸騰回流10h，取下回流冷卻器，在通風櫥中加入硫酸鋰50g、水50mL和數滴濃溴水（99％），再微沸15min，以除去多餘的溴（冷後仍有綠色需再加溴水，再煮沸除去過量的溴），冷卻，加水定容至1000mL。混勻，過濾。製得的試劑應呈金黃色，貯存於棕色瓶中。使用溶液：1份福林試劑與2份水混合，搖勻。
（2）0.4mol／L碳酸鈉溶液：稱取無水Na2CO342.4g，用水溶解並定容至1000mL。
（3）0.4mol／L三氯乙酸溶液：稱取三氯乙酸65.4g，用水溶解並定容至1000mL。
（4）0.5mol／LNaOH溶液。
（5）1mol／L及0.1mol／L的鹽酸溶液。
（6）緩衝液：
a磷酸緩衝液（pH7.5）：適用於中性蛋白酶。
稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.5g，加水溶解並定容至1000mL。
b乳酸緩衝液（pH3.0）：適用於酸性蛋白酶。
甲液：稱取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解並定容至1000mL。
乙液：稱取乳酸鈉（70％）16g，加水溶解並定容1000mL。
使用溶液：取甲液8mL，加乙液1mL，混勻，稀釋1倍，即成為0.05mol／L乳酸緩衝液。
c硼酸緩衝液（pH10.5）：適用於堿性蛋白酶。
甲液：稱取硼酸鈉（硼砂）19.08g，加水溶解並定容1000mL。
乙液：稱取氫氧化鈉4.0g，加水溶解並定容至1000mL。
使用溶液：取甲液500mL、乙液400mL混勻，用水稀釋至1000mL。
上述各種緩衝溶液，均需用pH計校正。
（7）10g／L酪素溶液：稱取酪素1.000g，精確至0.001g，用少量0.5mol／LNaOH溶液（若酸性蛋白酶則用濃乳酸2～3滴）濕潤後，加入適量的各種適宜pH的緩衝溶液約80mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻後，轉入100mL容量瓶中，用適宜的pH緩衝溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內貯存，有效期為3天。
（8）100μg／mlL-酪氨酸標準溶液：
a稱取預先於105℃幹燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精確至0.0002g，用1mol／L鹽酸60mL溶解後定容至100mL，即為1mg／mlL-酪氨酸標準溶液。
b吸取1mg／mLL-酪氨酸標準溶液10.00mL，用0.1mol／L鹽酸定容至100mL，即得到100μg／mLL-酪氨酸標準溶液。
2.器材
電子天平、恒溫水浴鍋、分光光度計、移液管、試管、容量瓶等。
3.材料
蛋白酶製劑。
b分別取上述溶液各1.00mL（需做平行試驗），各加0.4mol／L碳酸鈉溶液5mL，福林試劑使用溶液1.00mL，置於（40±0.2）℃水浴中20min，取出，用分光光度計於波長680nm比色，以不含酪氨酸的0管為空白，分別測定其吸光度，以吸光度A為縱坐標，酪氨酸濃度C為橫坐標繪製標準曲線（此線應通過零點）。
根據作圖或用回歸方程，計算出當吸光度為1時的酪氨酸的量（μg），即為吸光常數K值，其K值應在95～100範圍內。
2.蛋白酶活力測定
（1）待測酶液的製備稱取酶粉1～2g，精確至0.0002g（或吸取液體酶1.00mL），用少量該酶的緩衝液溶解，並用玻璃棒搗研，然後將上清液小心傾入適合的容量瓶中，沉渣中再添加少量上述緩衝液溶解，搗研3～4次，最後全部移入容量瓶中，用緩衝液定容至刻度，搖勻。用4層紗布過濾，濾液應根據酶活力再一次用緩衝液稀釋至適當濃度，供測試用（稀釋至被測試液吸光值在0.25～0.40範圍內）。
（2）測定
①先將酪素溶液放入（40±0.2）℃恒溫水浴中預熱5min。
②按下圖程序操作：
試管A（空白）加酶液100mL
（40±0.2）℃，2min
加三氯乙酸2.00mL（搖勻）
（40±0.2）℃，10min
加酪素溶液1.00mL（搖勻）
取出靜置10min，過濾
取1.00mL濾液
加碳酸鈉溶液5.0mL
加福林試劑使用液1.00mL
（40±0.2）℃，顯色20min
於680nm波長用10mm比色皿測其吸光度
試管B（酶樣品，需做3個平行樣）
加酶液1.00mL
（40±0.2）℃，2min
加酪素1.00mL（搖勻）
（40±0.2）℃，10min
加三氯乙酸溶液2.00mL（搖勻）
取出靜置10min，過濾
取1.00mL濾液
加碳酸鈉溶液5.0mL
加福林試劑使用液1.00mL
（40±0.2）℃，顯色20min
於680nm波長用10mm比色皿測其吸光度
【結果處理】
X=A×K×4／10×n=2／5×A×K×n
式中X——樣品的酶活力；
A——樣品平行實驗的平均吸光度；
K——吸光常數；
4——反應試劑的總體積，mL；
10——反應時間10min，以1min計；
n——稀釋倍數。
所得結果表示至整數。
結果的允許誤差：平行實驗相對誤差不得超過3％。
實驗三十四：大蒜超氧化物歧化酶（SOD）的
分離提取與活力測定
【實驗目的】
（1）了解有機溶劑沉澱蛋白質的原理。
（2）掌握細胞破碎的方法。
（3）學會使用高速冷凍離心機，並鞏固紫外分光光度計的操作使用技術。
【實驗原理】
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）廣泛存在於各類生物體內，按其所含金屬離子的不同，可分為3種：銅鋅超氧化物歧化酶（Cu·Zn-SOD）、錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。在生物體內，它是一種重要的自由基清除劑，能治療多種炎症、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老，對生物體有保護作用。
在大蒜蒜瓣和懸浮培養的大蒜細胞中含有較豐富的SOD，通過組織或細胞破碎後，可用pH8.2的磷酸鹽緩衝液提取，提取液用低濃度的氯仿——乙醇處理，離心後去除雜蛋白沉澱，得SOD粗酶液，由於SOD不溶於丙酮，可用丙酮將其沉澱析出。
極性有機溶劑能引起蛋白質脫去水化層，並降低介電常數而增加帶電質點間的相互作用，致使蛋白質顆粒凝集而沉澱。采用這種方法沉澱蛋白質時，要求在低溫下操作，並且需要盡量縮短處理時間，避免蛋白質變性。
本實驗采用鄰苯三酚自氧化法來測定SOD的酶活性。
鄰苯三酚自氧化的機理極為複雜，它在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2——，生成帶色的中間產物。反應開始後，反應液先變成黃棕色，幾分鍾後轉綠，幾小時後又轉變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結果。這裏測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段。中間物的積累在滯留30～45s後，與時間呈線性關係，一般線性時間維持在4min的範圍內。中間物在320nm波長處有強烈光吸收，當有SOD存在時，由於它能催化O2——與H+結合生成O2和H2O2，從而阻止了中間物的積累，因此，通過計算就可求出SOD的酶活力。
鄰苯三酚自氧化速率受pH、濃度和溫度的影響，其中pH影響較大，因此，測定時要求對pH嚴格控製。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）新鮮蒜瓣。
（2）磷酸鹽緩衝液 0.05mol／L，pH8.2。
（3）氯仿——乙醇混合溶劑：氯仿：無水乙醇=3：5（體積比）。
（4）丙酮：用前預冷至4～10℃。
（5）10mmol／LHCl。
（6）鄰苯三酚：用10mmol／LHCl將鄰苯三酚配製成50mmol／L的溶液。
（7）碎冰。
2.器材
GL-2IM高速冷凍離心機、紫外分光光度計、離心管、恒溫水浴鍋、吸管、量筒、燒杯、容量瓶、研缽、托盤天平。
【實驗操作】
1.組織和細胞的破碎
稱取5g左右的大蒜蒜瓣，置於研缽中研磨，使組織或細胞破碎。
2.SOD的提取
將上述破碎的組織或細胞，加入2～3倍體積（約10mL）的0.05mol／L，pH8.2的磷酸鹽緩衝液，繼續研磨攪拌20min，使SOD充分溶解到緩衝液中，然後用離心機在4℃，8000r／min下離心15min（10000r／min，10min），棄沉澱，得粗提取液。測量粗提取液體積，並準確留樣0.5mL於3號試管中。
3.去除雜蛋白
留樣後剩餘的粗提取液中加入0.25倍體積的氯仿——乙醇混合溶劑攪拌15min，8000r／min，離心15min（10000r／min，10min），去除雜蛋白沉澱，得提取液。量取提取液體積，並準確留樣0.5mL於4號試管中。
4.SOD的沉澱分離
在上述留樣後剩餘的提取液中加入等體積的冷丙酮，混勻後置冰浴中放置15min，8000r／min離心15min（10000r／min，10min），棄上清液，得SOD沉澱。
將SOD沉澱溶解於1ml0.05mol／L、pH8.2的磷酸鹽緩衝液中，於55～60℃熱處理15min除不耐熱的雜蛋白，8000r／min離心15min（10000r／min，10min），棄沉澱，得到SOD酶液。量取SOD酶液體積，並準確留樣0.5mL於5號試管中。
5.SOD活力測定
（1）鄰苯三酚自氧化速率的測定在1-2號試管中按下麵加入磷酸鹽緩衝液，25℃下保溫20min，然後加入25℃預熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol／LHCl代替鄰苯三酚）迅速搖勻，立即傾入比色杯中，以1號空白管調零，在320nm波長處測定2號對照管的光密度OD（A）值。每隔1min讀數一次，共計時4min，要求自氧化速率控製在0.07OD／min（可通過增減鄰苯三酚的加入量調節）。
（2）酶活力的測定按下麵加樣，操作與測定鄰苯三酚自氧化速率相同，也可以1號空白管調零，加入25℃預熱過的鄰苯三酚後，迅速搖勻，立即測定。根據酶活力大小可適當增減酶樣品的加入量。
酶活力單位的定義：在1mL反應液中，每分鍾抑製鄰苯三酚自氧化速率達50％時的酶量定義為一個酶活力單位，即在320nm波長處測定時，0.035OD／min為一個酶活力單位。若每分鍾抑製鄰苯三酚自氧化速率在35％～65％，通常可按比例計算，若數值不在此範圍時，應增加酶樣品加入量。
【結果處理】
酶活力的計算公式：
單位體積酶活力（U／mL）=A-BA×10050×反應液總體積×樣品液稀釋倍數樣品液體積
式中A——鄰苯三酚自氧化管（即對照管）的OD／min；
B——樣品管的OD／min。
【注意事項】
（1）丙酮一定要預冷，並盡量在較低溫度下（常於冰浴中）充分混勻後沉澱，並於低溫下（4℃）離心，以防蛋白質變性。
（2）分離提取SOD分別得到粗提取液、粗酶液和SOD酶液的每一步要留樣測定酶活，以便測定每步的酶活力以計算回收率。
（3）鄰苯三酚自氧化過程一般在4min的範圍內顏色加深與時間呈線性關係。因此鄰苯三酚加入後要迅速測定光密度值，否則會影響實驗結果。