實驗二十六：溫度、pH、激活劑、抑製劑對酶活力的影響
【實驗目的】
（1）理解和領會不同因素對酶活性影響的原理。
（2）掌握不同因素對酶活力影響的測定方法。
（3）正確解釋實驗中各試管內溶液顏色變化的原因。
【實驗原理】
研究酶的活力時通常測定酶所作用的底物在酶作用前後產生的變化。本試驗以唾液澱粉酶作用於底物澱粉為例，通過不同環境條件下（溫度、pH、激活劑和抑製劑等）該酶分解澱粉生成各種糊精和麥芽糖等水解產物的變化，來觀察澱粉酶的活性。唾液澱粉酶對澱粉的水解過程如下：
澱粉→
紫色糊精→
紅色糊精→
麥芽糖
與碘顏色反應藍色紫色紅色無色
【試劑與器材】
1.試劑
（1）0.5％澱粉溶液取澱粉0.5g加蒸餾水少許攪拌成糊狀，然後用煮沸的1％氯化鈉溶液稀釋至100mL。
（2）碘溶液取碘化鉀2g及碘1.27g溶解於200mL水中，使用前用水稀釋5倍。
（3）磷酸氫二鈉——檸檬酸緩衝液pH5.0、pH6.6、pH8.0（見附錄）。
（4）0.5％NaCl溶液。
（5）1％CuSO4溶液。
2.器材
水浴鍋、電爐、比色盤、試管、吸管、燒杯。
3.材料
唾液澱粉酶。
【實驗操作】
1.製備稀釋唾液
用蒸餾水漱口3次，然後取蒸餾水20mL含於口中，1min後吐入燒杯中，紗布過濾，取濾液10mL，稀釋至20mL即為稀釋唾液，供實驗用。
2.溫度對酶活力的影響
（1）取試管3支，編號後按下麵操作。
管號：1、2、3
0.5％澱粉溶液／mL：3.0、3.0、3.0
稀釋唾液／mL：1.0、1.0、1.0
溫度？
0℃水浴、37℃水浴、沸水浴
（2）以上各管搖勻後，放入各自的水浴中，在白色比色盤上，各孔滴加碘液2滴，每隔1min，從第二管中取反應液1滴與碘液混合，觀察顏色變化。
（3）待第二管中反應液遇碘液不發生顏色變化時，把三個管從各自的水浴中取出（第三管要冷卻），向各管加入碘液2滴，搖勻，觀察並記錄各管顏色，說明溫度對酶活性的影響。
3.pH對酶活性的影響
（1）取試管3支，編號後按下麵操作。
管號：1、2、3
0.5％澱粉液／mL：3.0、3.0、3.0
pH5.0緩衝液／mL：1.0、-、-
pH6.6緩衝液／mL：-、1.0、-
pH8.0緩衝液／mL：-、-、1.0
稀釋唾液／mL：1.0、1.0、1.0
（2）以上各管搖勻後，放入37℃水浴中保溫，每隔1min從第二管中取反應液1滴與碘液混合觀察顏色變化並記錄。待第二管中反應液遇碘液不發生顏色變化時，向各試管加碘液1滴，觀察顏色並解釋結果。
4.激活劑和抑製劑對酶促反應速度的影響
（1）取試管3支，編號後按下麵操作。
管號：1、2、3
0.5％澱粉液／mL：2.0、2.0、2.0
pH6.6緩衝液／mL：1.0、1.0、1.0
蒸餾水／mL：1.0、-、-
0.5％NaCl溶液／mL：-、1.0、-
0.5％CuSO4溶液／mL：-、-、1.0
稀釋唾液／mL：1.0、1.0、1.0
（2）以上各管搖勻後，放入37℃水浴中保溫，每隔1～2min在比色盤上用碘液檢查2號管，待碘液不變色時，再向各管內加入碘液1～2滴，觀察並記錄各管顏色，解釋結果。
【結果處理】
觀察記錄實驗結果，正確解釋實驗中顏色變化的原因。
【思考題】
（1）何為酶的最適溫度，它有何應用意義？
（2）何為酶反應的最適pH？它對酶活性有什麼影響？
（3）何為酶的活化劑及抑製劑？酶的抑製劑與變性劑有何區別？
實驗二十七：琥珀酸脫氫酶的作用及其競爭性抑製
【實驗目的】
（1）理解酶競爭性抑製作用的原理。
（2）掌握實驗操作步驟。
【實驗原理】
動物組織中含有琥珀酸脫氫酶，此酶能催化琥珀酸脫氫轉變成延胡索酸，反應中生成的FADH2可使藍色的甲烯藍還原為無色的甲烯白。
丙二酸是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑製劑，它與琥珀酸的分子結構相似，故能與琥珀酸競爭酶的活性中心。丙二酸與酶結合後，酶活性受抑製，則不能再催化琥珀酸的脫氫反應。抑製程度的大小由抑製劑與底物兩者濃度的比例而定。
本試驗以甲烯藍作為受氫體，在隔絕空氣的條件下，琥珀酸脫氫酶活力改變可以通過甲烯藍的褪色程度來判斷，並以此觀察丙二酸對琥珀酸脫氫酶活性的抑製作用。
琥珀酸+甲烯藍琥珀酸脫氫酶無氧條件延胡索酸+甲烯白
【試劑與器材】
1.試劑
（1）0.2mol／L琥珀酸溶液。
（2）0.2mol／L丙二酸溶液。
（3）0.02mol／L丙二酸溶液。
以上三種溶液可用1mol／LNaOH調節至pH7.4，直接用其鈉鹽配製也可。
（4）1／15mol／L磷酸氫二鈉——磷酸二氫鉀緩衝液（pH7.4）。
（5）0.02％甲烯藍。
（6）液體石蠟。
2.器材
水浴鍋、離心機、研缽、台秤、剪刀、試管、吸管、滴管、離心管等。
3.材料
動物肝髒、心髒。
【實驗操作】
1.雞心髒或肝髒提取液的製備
取新鮮雞心或肝約3g，用蒸餾水清洗後剪成碎塊，置於研缽中，加入適量淨沙及pH7.4磷酸鹽緩衝液5mL，研磨成勻漿，再加入緩衝液6～7mL，攪勻，放置20min（不時攪拌），然後過濾或離心後取上清液備用。
2.取試管4支，編號後按下麵操作
試管號：1、2、3、4
0.2mol／L琥珀酸／mL：4、4、4、4
0.2mol／L丙二酸／mL：-、-、4、-
0.02mol／L丙二酸／mL：-、-、-、4
蒸餾水／mL：4、14、-、-
0.02％甲烯藍／mL：2、2、2、2
雞心髒提取液／mL：10、-、10、10
搖勻，於各管滴加液體石蠟10滴以隔絕空氣，置37℃水浴中保溫。
【結果處理】
（1）隨時觀察各管甲烯藍褪色情況，並記錄時間、解釋結果。
（2）第一管褪色後用力搖動，觀察有何變化並解釋。
【注意事項】
（1）加液體石蠟時，宜斜執試管，沿管壁緩緩加入，不要產生氣泡。
（2）加完液體石蠟後，不要振搖試管，以免溶液與空氣接觸使甲烯白重新氧化變藍。
【思考題】
（1）琥珀酸脫氫酶常見的競爭性抑製劑有哪些？
（2）甲烯藍指示劑的變色原因？
實驗二十八：蔗糖酶活力測定
【實驗目的】
（1）了解蔗糖酶的性質及3，5–二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶活力的實驗原理。
（2）熟練掌握其測定方法。
【實驗原理】
蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）又稱轉化酶，蔗糖在其作用下，水解為D–葡萄糖與D–果糖。酵母細胞含豐富的蔗糖酶（胞內酶），細胞破壁後釋放出來的蔗糖酶可以從果糖末端切開蔗糖的果糖糖苷鍵，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖是還原糖，其含量可通過3，5–二硝基水楊酸比色法測定，從而度量酶活力的大小。
蔗糖酶活力定義為：在35℃實驗條件下，每3min釋放1mg還原糖的酶量為1酶活單位。由於蔗糖酶在堿性條件下極易失活，所以可用堿終止酶解反應。
3，5–二硝基水楊酸定糖法實驗原理：3，5–二硝基水楊酸溶液和還原糖溶液共熱後被還原成棕紅色的氨基化合物，在520nm波長處有最大吸收峰，在一定範圍內其吸光度與還原糖含量呈線性關係，可用於還原糖含量測定。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）3，5–二硝基水楊酸試劑（DNS）：
甲液：稱取6.9g結晶酚溶於15.2ml10％NaOH中，並用水稀釋至69mL，在此溶液中加6.9gNaHSO3。
乙液：稱取255g酒石酸鉀鈉置於300ml10％NaOH中，再加入880ml1％3，5-二硝基水楊酸溶液。
將甲、乙兩溶液混合即得到顏色呈黃色的使用液，貯於棕色瓶中，室溫下放置7～10天後使用。
（2）葡萄糖標準使用液（1mg／mL）：稱取幹燥的葡萄糖0.1000g，溶於水並定容至100mL。
（3）5％蔗糖溶液：稱取5.00g蔗糖用pH5.5 0.1mol／L醋酸——醋酸鈉緩衝溶液（pH5.5）配製成100mL。
（4）1mol／LNaOH。
2.器材
電熱恒溫水浴鍋、721分光光度計、秒表或手表。
3.材料
蔗糖酶。
【實驗操作】
1.標準曲線製備
選擇6支試管，按照下麵進行操作：試管號：0、1、2、3、4、5
葡萄糖標準溶液（mL）：0、0.15、0.3、0.45、0.60、0.75
葡萄糖含量（mg）：0、0.15、0.3、0.45、0.60、0.75
蒸餾水（mL）：1.0、0.85、0.70、0.55、0.40、0.25
DNS試劑（mL）：1.5、1.5、1.5、1.5、1.5、1.5
搖勻，於沸水浴中加熱5min，迅速冷卻，加水定容至25mL
A520nm
使用1cm比色皿，在520nm波長條件下，以空白調零，測定各管吸光值。
用坐標紙繪製標準曲線或用回歸法計算求出以A520nm值為自變量，葡萄糖含量（mg）為因變量的直線方程。
2.蔗糖酶活力測定
（1）吸取稀釋的供試酶液2.0mL於試管1中，再加1ml1mol／LNaOH滅酶，作為對照管。
（2）另取稀釋酶液2.0mL於試管2中。然後將1、2號試管及5％蔗糖試劑放入35℃水浴中預熱10min，然後分別吸2.0mL經預熱的5％蔗糖溶液加入試管1，2中，立即記時，酶促反應3min，再向試管2加入1mol／LNaOH1mL滅酶，搖勻。
（3）取適量的酶促反應液，用測定葡萄糖含量的DNS試劑定糖法，以1號管調零，測定酶促反應液A520nm值，與葡萄糖標準曲線比較，求出酶促反應液中還原糖含量。作2次平行試驗。
【結果處理】
蔗糖酶活力（U／mL）=A520nm相當的葡萄糖質量（mg）2×V×4
式中V——測定時樣品的體積（mL）。
【注意事項】
定糖實驗，不當的操作易引起較大的誤差，所以DNS試劑加入時，應盡量準確無損地加至試管底部，控製沸水浴加熱反應時間。
【思考題】
（1）蔗糖酶活力測定時，1號對照管並無進行酶促反應，但加入定糖試劑加熱後，溶液仍呈現紅棕色，原因何在？
（2）酶活力測定時用對照1號管調節分光光度計零點的目的是什麼？用求葡萄糖標準曲線時的試劑空白管調零點可以嗎？為什麼？
實驗二十九：血清轉氨酶活力測定
【實驗目的】
（1）掌握測定穀丙轉氨酶活力的原理。
（2）掌握穀丙轉氨酶活力測定的方法和注意事項。
【實驗原理】
穀丙轉氨酶（GPT）能催化丙氨酸和α——酮戊二酸生成穀氨酸和丙酮酸。丙酮酸在酸性條件下與2，4-二硝基苯肼，可縮合生成棕紅色的丙酮酸二硝基苯腙，在520nm處有最大光吸收，在一定的濃度下，其顏色的深淺符合比爾定律。通過比色法，可計算出轉氨酶活性。
GPT在肝髒含量最多，在肝髒的早期損害或病毒肝炎的急性階段，由於肝細胞損傷GPT就釋放進入血液，使血清中此酶水平明顯升高。因此測定血清中穀丙轉氨酶活力可作為診斷肝病的重要手段。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）2mmol／L丙酮酸標準溶液：稱取22mg丙酮酸鈉，溶於pH7.4磷酸緩衝液中，定容至100mL。
（2）GPT底物溶液：稱取α——酮戊二酸87.6mg，丙氨酸5.34g用90ml0.1mol／LpH7.4磷酸緩衝液溶解，然後用20％NaOH調節pH為7.4，再用磷酸緩衝液，定容至300mL，4℃保存，一周內使用。
（3）0.1mol／LpH7.4磷酸緩衝液。
（4）2，4-二硝基苯肼溶液：稱取19.8mg2，4-二硝基苯肼置於100mL容量瓶中，用8mL濃鹽酸溶解後，再加水稀釋到刻度。
（5）0.4mol／LNaOH溶液。
2.實驗器材
恒溫水浴鍋、分光光度計、移液管、試管等。
3.材料
魚肌肉勻漿或血清。
【實驗操作】
1.標準曲線的製備
取幹淨試管6支，編號後按照下麵添加試劑。混勻後各管加入GPT底物溶液0.5mL，將試管置於37℃水浴中保溫10min，然後向每管中加入0.5ml2，4-二硝基苯肼，再繼續保溫20min，再分別向各管中加入0.4mol／LNaOH溶液5mL，室溫下靜置10min。用0號管作為空白對照，於520nm下下測定吸光值。以各管吸光值為縱坐標，丙酮酸的濃度為橫坐標做標準曲線。
管號：0、1、2、3、4、5
2mmol／L丙酮酸標準溶液／mL：0.00、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25
磷酸緩衝液／mL：0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0
2.GPT活力測定
取幹淨試管4支，按照下麵添加試劑
試劑：測定1、對照1、測定2、對照2
血清／mL：0.25、0.25、0.25、0.25
GPT底物溶液／mL：0.5、-、0.5、-
37℃水浴加熱30min（轉氨基反應）
2，4-二硝基苯肼溶液／mL：0.5、0.5、0.5、0.5
GPT底物溶液／mL：-、0.5、-、0.5
37℃水浴加熱20min（丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應）
0.4mol／LNaOH溶液／mL：5、5、5、5
混勻，室溫下靜置10min後，以對照管1或者2調節零點，測定1號管和2號管的吸收值。
【結果處理】
由標準曲線查出測定1號管和測定2號管中的丙酮酸的濃度。根據下麵的公式計算出GPT的活性：
GPT活力（單位）=反應管中丙酮酸的量（mmol／L）／0.5h×0.25mL
GPT活力單位的定義：單位時間（每小時）內，單位體積（每mL）的酶反應生成的產物的量（mmol／L）