（4）10mg／mL溴化乙啶：稱取1g溴化乙啶，置於100mL燒杯中，加入80mL去離子水後攪拌溶解。將溶液定容至100mL後，轉移到棕色瓶中。室溫避光保存。
（5）DNA標準相對分子質量溶液（DNAMarker）：DL2000Marker，含六條帶，片段大小分別為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
（6）6×上樣緩衝液：0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯青FF，30％甘油。
溴酚藍25mg；二甲苯青FF25mg；甘油3mL；用6×TAE緩衝液定溶至10mL，分裝成1mL／管。——20℃保存。
（7）DNA樣品：羊基因組DNA的PCR產物。
（8）其他試劑：瓊脂糖。
2.器材
（1）電泳儀、電泳槽及灌膠模具。
（2）電爐或微波爐。
（3）微量移液器。
（4）紫外檢測儀或凝膠成像係統。
（5）燒杯、量筒、三角瓶等。
3.材料
製備DNA。
【實驗操作】
1.瓊脂糖凝膠板的製備
製備1％瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖置於錐形瓶中，加入100mL1×TAE，瓶口倒扣小燒杯，置於微波爐中加熱煮沸至瓊脂糖充分溶解，搖勻；冷卻至60℃左右時，加入溴化乙錠至最終濃度為0.5μg／mL，充分混勻；倒入水平放置的製膠模中，厚度為2～3mm，插入梳子；室溫下靜置30～45min，讓凝膠溶液充分凝結；凝膠完全凝固後，將凝膠板放入電泳槽中；加入1×TAE電泳緩衝液，剛好沒過膠麵約1mm，小心取出梳子。
2.點樣
將DNA樣品和6×上樣緩衝液以5：1的體積比混合，用微量移液器將樣品混合液緩慢加至凝膠的加樣孔中。
3.電泳
一般電壓不超過5V／cm，電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離範圍降低。樣品由負極向正極方向移動，當溴酚藍移動到距膠板前沿邊緣約2～3cm處時，停止電泳。
【結果處理】
1.觀察和拍照
當溴酚藍在凝膠中移出適當距離後（約半小時），切斷電流，取出凝膠。在紫外燈（254nm波長）下觀察染色後的凝膠，DNA區帶呈現橙紅色的熒光。用紫外檢測儀拍照，也可采用凝膠成像係統輸出照片。
2.DNA相對分子質量估算
根據照片，將樣品DNA的位置與標準DNA的位置相對照，估計樣品中DNA組分的相對分子質量。
【注意事項】
（1）溴化乙錠是致癌物，操作時要戴防護手套。
（2）在紫外燈下觀察結果，要放下防護罩，以免眼睛受紫外輻射損傷。也可用手提式紫外燈照射凝膠進行結果觀察，這樣安全些。
（3）製備凝膠板時，一定要等溶解後的瓊脂糖冷卻至60℃左右再倒入成形板上，以免該板受熱變形。
【思考題】
（1）如何根據DNA的相對分子質量不同選用不同的凝膠濃度？
（2）試分析DNA條帶信號模糊、弱、甚至缺失的原因。
（3）瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率有哪些因素的影響？
實驗二十三：二苯胺顯色法測定DNA含量
【實驗目的】
（1）了解並具體掌握二苯胺顯色法測定DNA含量的原理和方法。
（2）掌握分光光度計的使用方法。
【實驗原理】
DNA主要集中在細胞核內，因此，通常選用細胞核含量比例大的生物組織作為提取製備DNA的材料。小牛胸腺組織中細胞核比例較大，因而DNA含量豐富，同時其脫氧核糖核酸酶（DNase）活性較低，製備過程中DNA被降解的可能性相對較低，所以是製備DNA的良好材料。但其來源較困難，脾髒較易獲得，也是實驗室製備DNA常用的材料。
脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環境中與二苯胺試劑一起加熱產生藍色反應，在595nm處有最大光吸收。DNA在40～400g範圍內，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應。其他多數糖類，包括核糖在內，一般無此反應。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）200mg／mlDNA標準溶液。
（2）二苯胺試劑使用前稱取1g結晶二苯胺，溶於100mL分析純冰醋酸中，加60％過氯酸10mL混勻。臨用前加入1ml1.6％乙醛溶液。此溶劑應為無色。
2.器材
可見分光光度計、恒溫水浴鍋、分析天平。
【實驗操作】
1.標準曲線的製作
取12隻試管分成6組，按下麵操作。取2管的平均值，以DNA濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪製標準曲線。
試管：0、1、2、3、4、5
標準DNA／mL：0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0
蒸餾水／mL：2、1.6、1.2、0.8、0.4、0
二苯胺試劑／mL：4、4、4、4、4、4
60℃恒溫水浴中保溫1h，冷卻，在595nm波長處比色
光密度值
2.樣品的測定
取待測樣品2mL，加入二苯胺溶液4mL，搖勻，60℃保溫1h，然後在595nm波長出測定光密度值。根據測得的光密度值，從標準曲線上查得相應的DNA的質量，按下式計算待測樣品的DNA的含量。
DNA（％）＝待測樣品中測得的DNA質量（mg）待測樣品液中樣品的質量（mg）×100
【思考題】
（1）DNA含量測定的方法有哪些？各有何優缺點？
（2）簡述二苯胺法測DNA的基本原理。
實驗二十四：地衣酚顯色法測定RNA含量
【實驗目的】
（1）掌握二苯胺顯色法測定DNA含量的原理和方法。
（2）進一步熟悉分光光度計的使用方法。
【實驗原理】
RNA與濃鹽酸共熱時發生降解，產生的戊糖又可轉變為糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛與地衣酚（3，5-二羥基甲苯）反應形成綠色複合物，該產物在670nm處有最大吸收。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）RNA標準液：稱取10mgRNA（需先定磷確定其純度）用少量水溶解（若不溶可用2mol／LNaOH溶液調至pH7.0），定容至100mL，濃度為100μg／mL。
（2）RNA樣品液：提取的RNA樣品。
（3）地衣酚試劑：取0.1g地衣酚溶於100mL濃鹽酸，再加入0.1gFeCl3·6H20。該溶液使用前新鮮配製。
2.器材
恒溫水浴，分光光度計。
【實驗操作】
1.標準曲線的繪製
取幹燥試管6支，編號，按下麵所示加入試劑。
試管號：0、1、2、3、4、5
RNA標準溶液／mL：0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5
蒸餾水／mL：1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5
地衣酚試劑／mL：3.0、3.0、3.0、3.0、3.0、3.0
A670
加樣完畢後混勻，於沸水浴中加熱20min，取出置自來水中冷卻，以零號管為對照，670nm處測吸光度。以吸光度為縱坐標，RNA濃度為橫坐標，繪製標準曲線。
2.樣品測定
取試管3支，兩支為樣品管，一支為空白管，在樣品管中加入1.0mL樣品液，再加3.0mL地衣酚試劑，混勻，置沸水浴中加熱20min，取出冷卻。空白管操作與標準曲線製作中零號管相同。以空白管調零點，於670nm處測吸光度，根據吸光度值從標準曲線上查出相應的RNA含量。
【結果分析】
（1）地衣酚反應特異性較差，凡戊糖均有此反應，DNA及其他雜質也有影響。故一般測定RNA時，可先測定樣品中DNA含量，再算出RNA含量。
（2）本法較靈敏。樣品中蛋白質含量高時，應先用5％三氯醋酸溶液將蛋白質沉澱後再測定，否則將發生幹擾。
實驗二十五：定磷法測定核酸含量
【實驗目的】
掌握定磷法測定核酸含量的原理和方法。
【實驗原理】
Fiske-Subbarow定磷法是一經典的但至今仍被經常采用的方法，它具有靈敏、簡便的特點。核酸分子結構中含有一定比例的磷（RNA含磷量為8.5％～9.0％，DNA含磷量約為9.2％），測定其含磷量即可求出核酸的量，這就是定磷法的理論依據。核酸分子中的有機磷經強酸消化後形成無機磷，在酸性條件下，與鉬酸鹽（常用鉬酸銨或鉬酸鈉）反應生成磷鉬酸鹽絡合物。用還原劑處理，磷鉬酸鹽絡合物被還原生成鉬藍，在660nm處有最大吸收峰。在一定濃度範圍內，顏色的深淺與磷含量成正比關係。因此可以用分光光度法進行磷的定量測定。其反應為：
（NH4）2MoO4+H2SO4→H2MoO4+（NH4）2SO4
H3PO4+12H2MoO4→H3P（Mo3O10）4+12H2O
H3P（Mo3O10）4→Mo2O3MoO3
生物有機磷材料中有時含有無機磷雜質，故用定磷法來測定該有機磷物質的量時，必須分別測定該樣品的總磷量，即樣品經過消化以後所測得的含磷量，以及該樣品的無機磷含量，即樣品未經消化直接測得的含磷量。將總磷量減去無機磷才是該有機磷物質的含磷量。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）標準磷溶液：將磷酸二氫鉀於110℃烘至恒重，準確稱取0.8775g溶於少量蒸餾水中，轉移至500mL容量瓶中，加入5mL5mol／L硫酸溶液及氯仿數滴，用蒸餾水稀釋至刻度。此溶液每1mL含磷400μg，臨用時準確稀釋20倍（20μg／mL）。
（2）定磷試劑
①17％硫酸：17mL濃硫酸（相對密度l84）緩緩加入到83mL水中。
②2.5％鉬酸銨溶液：2.5g鉬酸銨溶於100mL水。
③10％抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶於100mL水，並貯存於棕色瓶中，溶液呈淡黃色尚可使用，呈深黃甚至棕色即失效。
臨用時將上述三種溶液與水按如下比例混合：
溶液①：溶液②：溶液③：水=1：1：1：2（V：V）
（3）5％氨水。
（4）27％硫酸。
2.器材
恒溫水浴，721分光光度計。
【實驗操作】
1.磷標準曲線的繪製
取試管7支，0～6依次編號。按下麵加入各試劑。注意每加好一種試劑後應立即搖勻。
管號名稱：0、1、2、3、4、5、6
標準磷溶液／mL：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0
6mol／L硫酸／mL：0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5
25g／L鉬酸銨／mL：0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5
還原劑／mL：0.1、0.1、0.1、0.1、0.1、0.1、0.1
蒸餾水／mL：3.9、3.4、2.9、2.4、1.9、1.4、0.9
各反應液加畢後，於30℃保溫20min，置分光光度計中在波長660nm比色，測光吸收值。以磷含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標作圖，即得定磷標準曲線。
2.總磷量的測定
取30毫升凱氏燒瓶2隻，Ⅰ、Ⅱ依次編號。Ⅰ號瓶為空白對照，加入蒸餾水1.0mL用刻度吸管準確吸取核糖核酸樣液1.0mL，置於Ⅱ號凱氏燒瓶內。兩瓶分別加入6mol／L硫酸1.0mL置消化架用小火加熱消化，待溶液呈褐色，稍加冷卻，加入2mol／L硝酸2滴，再繼續加熱，直至逸出白色煙霧，溶液無色透明，表示消化完成時為止。待凱氏燒瓶冷卻後，分別加入1.0mL蒸餾水，置沸水浴蒸煮5min，使焦磷酸分解。凱氏燒瓶從沸水浴中取出，待其冷卻，將Ⅰ和Ⅱ號瓶內的消化液分別移入兩隻10mL容量瓶中，用少量蒸餾水洗滌凱氏燒瓶兩次，並將洗滌液一並倒入容量瓶內，再各加蒸餾水稀釋至刻度。
取試管3支，按7～9依次編號，7號管為空白對照。
準確吸取空白對照液1.0mL，置於7號管內，再分別準確吸取Ⅱ號瓶經過消化的核糖核酸樣液1.0mL，置於8、9號管內，以下操作與磷標準曲線繪製相同。測出光密度，即可由繪製的標準曲線查得核糖核酸經消化稀釋後的總磷量。
3.無機磷的測定
取試管3支，按10～12依次編號，10號管為空白對照。用刻度吸管分別準確吸取未經消化的核糖核酸液1.0mL，作為無機磷測定樣液，置於11、12號管內，空白管以蒸餾水代替RNA液，以下操作與磷標準曲線繪製相同。測出光密度，即可由繪製的標準曲線查得無機磷含量。若溶液渾濁，影響測定光密度，可在加入試劑搖勻後，進行過濾或置離心機3000r／min離心15min，取其上清液再測定。
4.有機磷的測定
按上述方法分別測得總磷和無機磷的光密度，自總磷的光密度扣除無機磷的光密度，即為消化稀釋後樣液有機磷的光密度。
有機磷A660（％）＝總磷A660無機磷A66010×100
再由磷標準曲線查得有機磷含量。
【結果分析】
計算樣品中核酸的含量：
核酸（％）=
有機磷含量（μg）測定時取樣體積（mL）
×稀釋倍數×11
樣品質量（μg）
×100
【思考題】
（1）采用定磷法測定樣品的核酸含量，有何優點及缺點？
（2）若樣品中含有核苷酸類雜質，應如何校正？