所有分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分離和純化質粒DNA。
裂解細菌的方法很多，如SDS法、堿裂解法、煮沸法等。它們各有利弊，應根據所提質粒的性質、宿主菌的特性及純化質粒的方法等因素加以選擇。本實驗采用堿裂解法。首先破壞細菌的細胞壁，再用SDS使細胞膜崩解，與此同時用NaOH提高溶液的pH，使染色體DNA、蛋白質及質粒均變性。
在很高的pH條件下，SDS處理EColi，使其細胞壁、細胞膜分別破裂，即發生溶菌作用。線性的染色體DNA在這種強堿的環境中發生不可逆的變性作用。它們纏繞在膜的碎片上，易於被沉澱，而分子較小的質粒DNA仍留在水相之中。用RNaseA除去溶液中的RNA分子，並經苯酚、氯仿的抽提，進一步除去蛋白質。即可得到質粒的初製品。
質粒PUC18主要以兩種狀態存在，即共價閉環DNA，也就是超螺旋形式的質粒DNA分子和開環DNA，此時，環狀的DNA分子中帶有一個或幾個缺口，超螺旋解離，也稱微Nicked DNA。新純化的質粒DNA以超螺旋形式為主，這也是檢驗質粒純化質量的一個標準。操作不當或長期貯存可使開環DNA的比例顯著升高。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）pH8.0 GET緩衝液（50mmol／L葡萄糖，10mmol／LEDTA，25mmol／LTris-HCl）；用前加溶菌酶4mg／mL。
（2）pH4.8乙酸鉀溶液（60ml5mol／LKAc，11.5mL冰乙酸，28.5mlH2O）。
（3）酚／氯仿（1：1，V／V）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化劑8-羥基喹啉，使其濃度為0.1％，並用Tris-HCl緩衝液平衡兩次。氯仿中加入異戊醇，氯仿／異戊醇（24：1，V／V）。
（4）pH8.0 TE緩衝液：10mmol／LTris，1mmol／LEDTA，其中含有RNA酶（RNase）20μg／mL。
（5）TBE緩衝液：稱取Tris10.88g、硼酸5.52g和EDTA0.72g，用蒸餾水溶解後，定容至200mL，用前稀釋10倍。
（6）EB染色液：稱取5g溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB），溶於蒸餾水中並定容至10mL，避光保存。臨用前，用GET電泳緩衝液稀釋1000倍，使其最終濃度達到0.5μg／mL。
2.器材
（1）塑料離心管1.5mL×30。
（2）塑料離心管架×1。
（3）微量加樣器10μL、100μL、1000μL各一支。
（4）常用玻璃儀器及滴管等。
（5）台式高速離心機。
【實驗操作】
1.培養細菌
將帶有質粒的大腸杆菌DH5α接種在LB瓊脂培養基上，37℃培養24～48h。
2.從細菌中快速提取製備質粒DNA
（1）用3～5根牙簽挑取平板培養基上的菌落，放入1.5mL小離心管中，或取液體培養菌液1.5mL置小離心管中，4000r／min離心1min去掉上清液。加入150μL的GET緩衝液，充分混勻，在室溫下放置10min。
（2）加入200μL新配置的0.2mol／LNaOH，1％SDS 200μL。加蓋，顛倒2～3次使之混勻。冰上放置5min。
（3）加150μL冷卻的乙酸鉀溶液，加蓋後顛倒數次混勻，冰上放置15min。10000r／min離心5min，上清液倒入另一離心管中。
（4）向上清液中加入等體積酚／氯仿，震蕩混勻，4000r／min離心2min，將上清液轉移至新的離心管中。
（5）向上清液中加入等體積無水乙醇，混勻，室溫放置2min。離心5min，倒去上清乙醇溶液，將離心管倒扣在吸水紙上，吸幹液體。
（6）加1mL70％乙醇，震蕩並離心，倒去上清液，真空抽幹，待用。
3.質粒DNA的酶解
將自提質粒加入20μL的TE緩衝液，使DNA完全溶解。取清潔、幹燥、滅菌的具塞離心管編號，用微量加樣器按下麵所示將各種試劑分別加入每個小離心管內。
4.DNA瓊脂糖凝膠電泳
（1）瓊脂糖凝膠的製備稱取0.6g瓊脂糖，置於三角瓶中，加入50mLTBE緩衝液，經沸水浴加熱全部融化後，取出搖勻，此為1.2％的瓊脂糖凝膠。
（2）膠板的製備取橡皮膏（寬約1cm）將有機玻璃板的邊緣封好，水平放置，將樣品槽板垂直立在玻璃板表麵。將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，小心倒入，使膠液緩慢展開，直到在整個玻璃板表麵形成均勻的膠層，室溫下靜置30min，待凝固完全後，輕輕拔出樣品槽模板，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。用滴管將樣品槽內注滿TBE緩衝液以防止幹裂，製備好膠板後立即取下橡皮膏，將膠板放在電泳槽中使用。
（3）加樣用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內。每次加完一個樣品，要用蒸餾水反複洗淨微量加樣器，以防止相互汙染。
5.電泳
加完樣品後的凝膠板，立即通電。樣品進膠前，應使電流控製在20mA，樣品進膠後電壓控製在60～80V，電流為40～50mA。當指示前沿移動至距離膠板1～2cm處，停止電泳。
6.染色
將電泳後的膠板在EB染色液中進行染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的DNA條帶。
【結果處理】
在波長為254nm的紫外燈下，觀察染色後的電泳膠板。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。
【注意事項】
（1）純化DNA的方法主要依據染色體DNA比質粒DNA分子大得多，而且染色體DNA被斷裂成線狀分子，但質粒DNA為共價閉環結構，當加熱或用酸、堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發生變性，共價閉環的質粒DNA在冷卻和回到中性pH時即恢複其天然構象。
（2）EB染料的全名是3，8-二氨基——5-乙基——6苯基菲啶溴鹽。EB能插入DNA分子中堿基對之間，導致EB與DNA結合，DNA所吸收的260nm的紫外光傳遞給EB，或者結合的EB本身在300nm和360nm吸收的射線均在可見光譜的紅橙區，以560nm波長發射出來。EB染料有許多優點，如染色操作簡便、快速，室溫下染色15～20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出。但應特別注意的是，EB是誘變劑，配製和使用EB染色液時，應帶乳膠手套或一次性手套，並且不要將該染色液灑在桌麵或地麵上，凡是沾汙EB的器皿或物品，必須經專門處理後，才能進行清洗或棄去。
【思考題】
（1）染色體DNA與質粒DNA分離的主要依據是什麼？
（2）EB染料有哪些特點？在使用時應注意些什麼？
實驗二十一：PCR基因擴增DNA
【實驗目的】
（1）掌握PCR技術概念、原理、方法及應用。
（2）熟悉PCR儀的使用及注意事項。
（3）了解TaqDNA聚合酶的來源和特點，引物的設計原則。
（4）了解現代PCR技術的擴展。
【實驗原理】
單鏈DNA在互補寡聚核苷酸片段的引導下，可以利用DNA多聚酶按5′→3′方向複製出互補DNA。這時單鏈DNA稱為模板DNA，寡聚核苷酸片段稱為引物，合成的互補DNA稱為產物DNA。雙鏈DNA分子經高溫變性後成為兩條單鏈DNA，它們都可以作為單鏈模板DNA，在相應引物引導下，利用DNA聚合酶複製出產物DNA。多聚酶鏈式反應（polymerase chain renction，PCR）的原理類似於DNA的天然複製過程。在緩衝液中有引物、DNA合成底物dNTP存在下，經變性、退火和延伸即可合成產物DNA。經若幹個這樣的循環後，DNA即可擴增2n倍。具體過程如下。
（1）變性加熱使模板DNA在高溫（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。
（2）退火使溶液溫度逐漸降至50～60℃，模板DNA即可與引物按堿基配對原則互相結合。
（3）延伸再將溶液溫度逐漸升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物的4種脫氧核苷酸（dNTP），按5′→3方向複製出互補DNA。
上述3步為一個循環，樣本中的DNA量即可增加一倍，新形成的鏈又可為下一輪循環的模板，經過25～30個循環後，DNA可擴增106～109倍。
典型的PCR反應體係由如下組分組成：DNA模板、反應緩衝液、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Tag聚合酶。
【試劑和器材】
1.試劑
（1）DNA模板：0.1μg／μL人線粒體DNA（從人胎盤中抽取純化），使用前用TE緩衝液稀釋10倍置冰浴中。
（2）4種脫氧核苷酸（dNTP）：4種dNTP，即1mmol／LdNTP、1mmol／LdCTP、1mmol／LdGTP、1mmol／LdTTP。
（3）50nmol／L引物：
引物1（位於線粒體3108～3127bp）5′——TTCAAATTCCTCCCTGTACG-3′、
引物1（位於線粒體3717～3701bp）5′——GGCTACTGCTCGCAGTG-3′。
（4）2.5U／μL Tag聚合酶：如果市售濃度過高，可用酶稀釋液進行稀釋。
（5）酶稀釋液：含有50％甘油、50mmol／LNaCl、0.2g／L明膠、0.1％TritionX-100。
（6）DNA相對分子質量標準物。
（7）10倍緩衝液：含有500nmol／LKCl、10mmol／LTris-HCl（pH9.0）。
（8）15mmol／LMgCl2、0.1％（W／V）明膠、1％TrironX-100。
（9）石蠟油。
（10）DNA瓊脂糖凝膠電泳所需試劑。
2.器材
PCR熱循環儀、瓊脂糖凝膠電泳係統、加樣槍（另附槍頭若幹）。
【實驗操作】
（1）取0.5mlEppendorf管一個，用加樣槍按以下順序分別加入各種試劑：
10倍PCR緩衝液10μL
4倍dNTP8μL
引物11.0μL
引物21.0μL
線粒體模板DNA5μL
Tag1.0μL
加水至體積100μL
（2）加入100μL石蠟油。
（3）與94℃預變性5min，使DNA完全變性。
（4）按下述程序進行擴增
①94℃變性30s；
②52℃退火45s；
③72℃延伸45s；
④重複步驟①～③25～35次；
⑤72℃延伸10min。
（5）反應完畢，將樣品取出置於冰浴中待用。
（6）進行瓊脂糖電泳，分析PCR結果。
【結果處理】
本實驗PCR擴增的產物DNA片段長度為609bp，適合於1.5％瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。
【注意事項】
（1）加各試劑時，要注意準確操作。
（2）PCR儀運行時勿隨意改動。
（3）溴乙錠可引起基因突變，操作時要注意個人防護。
（4）紫外光對人眼有害，觀察結果時加蓋玻璃罩，觀察時間不宜太長。
實驗二十二：DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測
【實驗目的】
（1）熟練掌握瓊脂糖凝膠電泳技術的原理。
（2）理解影響瓊脂糖凝膠電泳的主要因素。
（3）能夠正確熟練進行瓊脂糖凝膠的製備。
【實驗原理】
瓊脂糖凝膠電泳是重組DNA研究中常用的技術，可用於分離、鑒定和純化DNA片段。不同大小、不同形狀和不同構象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩衝液等），有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。凝膠中的DNA可與熒光染料溴化乙錠（EB）結合，在紫外燈下可看到熒光條帶，借此可分析實驗結果。
電泳緩衝液的pH在6～9之間，離子強度0.02～0.05為最適。常用1％的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它製備容易，分離範圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的範圍為0.2～20kb，利用脈衝電泳，可分離高達107bp的DNA片段。
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由於糖——磷酸骨架在結構上的重複性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的淨電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）50×TAE緩衝液的配製（1L）：2mol／LTris-乙酸，0.05mol／LEDTA（pH8.0）。稱取Tris242g；冰乙酸57.1mL；0.5mol／LEDTA100mL；加入600mL去離子水後攪拌溶解，將溶液定容至1L後。高溫高壓滅菌，室溫保存。
（2）1×TAE緩衝液的配製：稱量20mL的50×TAE緩衝液，再加入980mL的去離子水。
（3）0.5mol／LEDTA（pH8.0）的配製：稱取186.1gNa2EDTA·2H2O，置於1L燒杯中；加入約800mL的去離子水，充分攪拌；用NaOH調節pH至8.0（約20gNaOH）；加去離子水將溶液定容至1L；適量分成小份後，高溫高壓滅菌；室溫保存。
注意：pH至8.0時，EDTA才能完全溶解。