亞曆山大圖書館內設有數學、醫學、天文學、文學四個部，由國家聘任著名學者在館內從事學術研究，並擔任圖書管理員，成為當時世界上主要的文化與學術中心之一。亞曆山大圖書館曆任的館長或館員均為當時著名學者：
1.澤諾多托斯（Zenodotus of Ephesus）是亞曆山大圖書館記錄中的第一任館長，其從托勒密一世晚期開始工作到西元前245年。
2.著名學者及亞曆山大派詩人代表卡利馬科斯（Callimachus，305？－240？ BC）也曾在亞曆山大圖書館中工作過，他曾編纂一份書目《卷錄》（Pinakes），共120卷。今有殘卷傳世，分為八大類：演說術、曆史、法律、哲學、醫學、抒情詩、悲劇及雜項。他是第一個編寫圖書目錄之人，並著錄了書名和作者等資訊，有學者認為他是古代第一個目錄學家，因此稱其為”圖書館科學之父”。盡管他為亞曆山大圖書館作出了巨大的貢獻，但是由於他的文學主張遭到當時主流作家們的排斥，他並未能被授予館長的職務。
3.卡利馬科斯之後由埃拉托色尼（Eratosthenes，275-149 BCE）於西元前235年接任第二任亞曆山大圖書館館長，他擁有非常豐富的地理與年代學（chronology）知識，托勒密三世在任時雇其為家教；
4.埃拉托色尼下一任館長為阿裏斯托芬（Aristophanes of Byzantium），他繼續澤諾多托斯的工作，大多在處理希臘詩集有關業務；如荷馬的史詩《伊利亞特》和《奧德賽》，就是先後由澤諾多托斯、阿裏斯托芬和阿利斯塔克斯三人在館內費時近百年，最後修訂為各二十四卷出版。
5.阿裏斯托芬後為阿利斯塔克斯（Aristarchus），其職責主要在皇室孩童的教育上。然而由於其同時也指導托勒密六世（Ptolemy VI Philometor）和其弟弟托勒密八世。費斯康（Ptolemy VIII Physcon），當托勒密八世上位後殺了他兄長成為法老王時，因阿利斯塔克斯曾教導過托勒密六世，而被視為敵人，被迫離開亞曆山大，最後死於西元145年。阿利斯塔克斯之後，沒人知道接下來圖書館歸誰管理。
館員重要發明與貢獻
數學方麵，埃拉托色尼計算出地球圓周，並經過精細觀察，推導出一年365又1/4天的月曆，他也是第一個提出每四年有一年是366天的學者。另一位圖書館員阿基米德（Archimedes）則發現了π；天文學方麵，埃拉托色尼創造了一個有475顆星鬥、44個星座的目錄，幫助埃及水手於地中海航行時的方向導航；
力學方麵，據說阿基米德發明阿基米德式螺旋抽水機（Archimedes screw），借用手搖裝置幫助打水；醫學方麵，由埃及人保存屍體的方式（木乃伊）可看出他們在醫學方麵的豐厚學識。亞曆山大圖書館在其存在的六百多年中，對古希臘和古羅馬的學術發展，尤其對繁榮圖書出版事業具有重要影響。
亞曆山大圖書館消失之謎
盡管古代的和拜占庭的許多史料都提到過亞曆山大圖書館的遭遇，但是它們相互矛盾、抵觸並混淆，而當時也沒有任何權威性的描述。曆史上一般把亞曆山大圖書館毀滅的責任歸咎於三個人。在公元前47～前48年間，裘力斯。愷撒大帝被圍困於此，他放火焚燒周圍的艦隊和港口時，火勢蔓延導致了亞曆山大圖書館意外遭殃。還有一種說法是，在公元391年，總主教提阿非羅手下的一個基督教暴徒在掃除薩拉皮雍異教時，搗毀了它。最後一種說法是，在公元640年，伊斯蘭軍隊征服了埃及，哈裏發。奧瑪下令在一處公共浴室燒毀了亞曆山大圖書館裏的藏書。在哈裏發。奧瑪看來，所有與古蘭經相悖的書籍，就應該被毀滅，而與之內容一致的，也沒有存在的必要。
這些公認的或傳奇的說法並非真實可信。這些傳說通常比事件發生的日期晚很多，都不能令人信服，因為古代作家傾向於粉飾故事或者是寫作時帶有政治或宗教觀點。另外，亞曆山大是個命運十分悲慘的城市，它遭到的動亂和洗劫實在太多，很難從大量的災禍中準確判斷是哪一次給了圖書館致命一擊。
公元前30年，奧古斯都征服亞曆山大港時，縱兵搶掠；為了洗盡公元215年所受的恥辱，卡拉戈拉大帝曾對亞曆山大人民進行了大屠殺；隨後，叛逆者們把它當成自己的基地，幾乎將其夷為平地；公元273年，奧裏利安大帝粗暴地摧毀了它；再後來，戴克裏安也在小範圍內對其進行破壞。到4世紀末，亞曆山大港已經成為一個非常小的城市，它的城牆、宮殿和偉大的圖書館都找不到了。