第二節 差異顯示篩選家蠶抗BmNPV基因
一、家蠶近等基因係構建
選擇家蠶對BmNPV高抗品係NB（LC50=8.25）和感性品係306（LC50=4.95），以306為輪回親本，以NB為抗性基因供體親本，雜交得到F1代，經過8代回交後，再經2代自交，使性狀得到純合，隔代經BmNPV添毒篩選，保留抗性基因，育成了近等基因係306NNZZ（簡寫為NL，BC8）（LC50=8.23）。
二、實驗設計
取家蠶抗BmNPV品係NB、感BmNPV品係306和近等基因係NL，采用單蛾催青、收蟻，飼養到5齡期，取一部分材料進行抗病性鑒定，然後每蛾區隨機分成2組，即R1、R2（NB）； S1、S2（306）； N1、N2（NL）。其中R1、S1、N13個材料作為添毒實驗組，對應的 R2、S2、N2作為非添毒組。
三、DD PCR獲得家蠶抗性相關差異片段
對於家蠶中腸和血液各材料的熒光差異顯示選擇了兩種熒光錨定引物（即FHT11 C和FHT11 G），以及16種隨機引物（即H AP 9~24），其中血液以FHT11 G對H AP12 、H AP13引物擴增結果差異條帶較為明顯，共獲得18條差異帶。我們選擇了一張比較有代表性的圖，從圖可以看出G13412引物擴增的412 bp 帶在抗性品係（R1，R2）和近等基因係（N1,N2）都有出現，而感性品係（S1,S2）無，G13313同樣如此（彩圖621）。
四、幾個相關的差異片段基因的研究
1. s3a研究
通過mRNA熒光差異顯示技術獲得了一條差異條帶，再通過電子延伸獲得了基因的cDNA全序列，並且得到了實驗驗證。S3A蛋白是位於大小核糖體亞基的接觸麵上，該部位是核糖體結合翻譯啟動因子2（elF2）、elF3、eF2、Met tRNA、Phe tRNA以及mRNA的位置，S3A水平的變化影響到核糖體翻譯功能的啟動，許多核糖體蛋白還具有一些核糖體外的功能，有研究表明由於核糖體蛋白S3A的降解抑製核糖體翻譯功能的啟動，阻礙了參與細胞生命活動的蛋白的合成，從而導致細胞凋亡。細胞凋亡作為利他性自殺行為是昆蟲抗病毒感染的重要機製，細胞通過自殺性調亡限製病毒的感染與複製保存個體與種族的生存。在實驗中，s3a基因在抗性材料中出現了高表達的現象，添毒誘導後也同樣出現高表達。因此，推測家蠶在給予BmNPV接種後，由於病毒的感染，在抗性品係中s3a基因的高表達促進了家蠶細胞的凋亡現象，導致病毒複製受到影響，從而表現出對病毒複製的抵抗性。
在對哺乳動物的研究中，Cordeiro da Silva （2001）等通過注射Leishmania major RPS3a 結合蛋白到老鼠體內，發現rLmS3arp能夠優先誘導B細胞的活性，說明rLmS3arp通過直接或間接作用於B細胞、T細胞和胞漿分泌，參與免疫調節過程，對TH1和TH2免疫反應起平衡作用。這是寄生蟲與脊椎動物宿主研究相互作用的典型例子，對於昆蟲病毒與宿主的關係可以提供借鑒和參考。因此，通過熒光差異顯示技術，成功地展示了可能與抗BmNPV相關的家蠶Bms3a新基因。
2. sop2研究
通過mRNA熒光差異顯示技術獲得了sop2，通過數據庫分析和RACE技術獲得完整的ORF。根據其編碼的蛋白分別與Anopheles gambiae、Drosophila melanogaster、African clawed frog、Mouse 和 Human SOP2 蛋白的同源性達到68%、65%、57%、56.2% 和 56.2%，所以定名為家蠶sop2基因。SOP2蛋白，即Suppressor of profilin 2，又名為Arpc1，是Arp2/3複合體的一個亞基，其功能是可以較大地提高肌動蛋白細索的低自發的合成效率，對改變細胞骨架起重要作用。
在研究AcMNPV對於肌動蛋白和病毒多角體複製的關係時發現，在病毒粒子進入細胞質不久，粗的肌動蛋白索形成了，它常常凸出連接細胞核，這種肌動蛋白索是瞬間結構，在病毒基因表達之前就與病毒核衣殼形成聯係，並協助病毒粒子轉移進入細胞核。Lanier等研究表明病毒粒子能夠在體外與肌動蛋白以濃度依賴的方式聚集，並發現兩個病毒編碼的核衣殼蛋白p39和p78/83直接與肌動蛋白結合，病毒粒子結合於肌動蛋白索的末端蛋白上，因此推測病毒粒子一旦進入細胞質，就誘導肌動蛋白索的聚合聯合類肌球蛋白的運動促進病毒粒子進入細胞核。1996年Volkman構建了重組病毒在感染的各個時相表達肌動蛋白，發現過量表達的肌動蛋白在轉錄後水平幹擾多角體的形成。Kasman等對6個鱗翅目昆蟲病毒（Spodoptera frugiperda MNPV、Bombyx mori NPV、Orgyia pseudotsugata MNPV、Lymantria dispar MNPV、Anticarsia gemmatalis MNPV、Helicoverpa zea SNPV）的研究發現，在有Cyto D和Latrunculin A（兩種與F actin結合的因子F actin結合的因子，幹擾F actin依賴的形態發生過程）存在的情況下病毒不能繁殖後代，表現為鱗翅目昆蟲宿主病毒共有的特征。Ohkawa等2002年對於肌動蛋白介導的病毒複製進行了更深入的研究，他們對病毒的6個早期基因研究認為宿主細胞核內G actin對病毒的早期基因的表達具有調節作用。葛國瓊等2004年研究了細胞鬆弛素D對棉鈴蟲NPV複製的影響認為細胞鬆弛素D並沒有影響病毒DNA的合成，而是通過影響細胞內肌動蛋白細絲的結構從而影響了NPV的包裝，因而認為宿主細胞的絲狀肌動蛋白對子代病毒的組裝和複製是必需的。另外，在對人類HIV 1的研究中也發現肌動蛋白意想不到的功能，細胞核肌動蛋白可以作為一個eIF 5A的結合蛋白不僅僅在參與輸出宿主蛋白如蛋白激酶抑製劑蛋白激酶抑製劑（PXI），還在逆轉錄病毒RNAs的核輸出起重要作用。