運用熒光定量PCR技術,經口接種等量BmNPV病毒後2小時,在NB、306和NL的中腸均檢測到了病毒,此時病毒拷貝數在這3組材料中無顯著性差異;12小時後,在血淋巴和脂肪體也都檢測到了病毒,而此時306血淋巴中的病毒拷貝數要比NB和NL高出2個數量級;此後在306的中腸、血淋巴和脂肪體3種組織中病毒均出現了對數增長,脂肪體內病毒增長出現得稍晚;72小時後,病毒在306體內3種組織中的增長進入了平台期,用顯微鏡檢測觀測血淋巴中有多角體形成,直到5天後核型多角體病發作。而NB和NL體內的病毒在潛伏期後先經過小幅上升,中腸和血淋巴在36小時後,脂肪體在48小時後病毒均維持在低濃度波動,72小時後NB和NL在3種組織中的病毒拷貝數與306相比相差5~8個數量級,而NB和NL之間無顯著性差異。依據此研究結果結合Bmsop2基因的不同時相的表達可以推論,在NB和NL的抗性品係中是由於病毒的複製受到影響而產生了抗性,而在感性品係中,由於病毒可以自由的大量複製使之成為感性品種,其作用機製可能是由於在感性品係中Bmsop2的高表達,利於在病毒入侵後Factin的形成,從而為病毒的複製提供了便利。
3. 家蠶癱瘓肽結合蛋白(B. mori paralytic peptide binding protein, PP BP)
昆蟲免疫係統在抵製外來寄生物的攻擊方麵起著非常重要的作用。入侵生物體在被宿主識別後,根據其大小,很快被巨噬細胞吞噬或被包囊起來。在包囊過程中,多種血細胞可能參與了該過程,並受到多種細胞因子和黏著分子的調節。昆蟲血細胞尤其是淋巴液的黏附性是針對外來侵入物的免疫應答過程中的重要因素。ENF肽家族具有保守的N末端結構(Glu Asn Phe )。該家族成員肽大多具有重疊功能活性,在鱗翅目昆蟲的免疫反應、生長調控和自體調節等方麵都發揮著重要的作用。家蠶癱瘓肽(paralytic peptide)家蠶癱瘓肽(paralytic peptide)是ENF肽家族的一種,具有多種的生物學活性,包括致癱瘓性及在家蠶血細胞免疫反應中的促吞噬細胞擴散活性。ENF肽家族的另一成員,黏蟲(Pseudaletia separata)的生長阻抑肽(growth blocking peptide)生長阻抑肽(growth blocking peptide),同家蠶癱瘓肽一樣在黏蟲的血細胞免疫反應中起到調節吞噬細胞的功能。目前,雖然細胞因子參與早期免疫反應的調節已經被證實,但關於昆蟲細胞免疫應答的終端調控分子機製的研究還比較少,有文獻報道黏蟲的生長阻抑肽結合蛋白(GBP BP)生長阻抑肽結合蛋白(GBP BP)能夠起到沉默生長阻抑肽活性的功能,從而可能參與調節細胞免疫應答的終端調控。
胡誌剛等在熒光差異顯示研究結果的基礎上,利用5′RACE技術,首次在家蠶中克隆得到了一條全長cDNA序列。通過同源性分析得知,該基因所編碼的蛋白質與黏蟲的生長阻抑肽結合蛋白具有很大的同源性,並被命名為家蠶癱瘓肽結合蛋白(B. mori paralytic peptide binding protein, PP BP)家蠶癱瘓肽結合蛋白(B. mori paralytic peptide binding protein, PP BP)。通過RT PCR研究發現,該蛋白基因在血淋巴中大量表達。同時,利用實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR)技術分析了該基因在正常飼養家蠶與添食BmNPV病毒的家蠶中的表達差異,結果顯示該基因在家蠶添食BmNPV病毒後的表達量大大增強,這就暗示該基因可能與BmNPV病毒刺激後所引起的家蠶血液細胞免疫反應相關。利用生物信息學方法對該基因的結構進行了分析,發現該基因具有2個外顯子和1個內含子。這個基因已經登入GenBank數據庫,收入號為DQ306881。
利用半定量RT PCR,分析得到了家蠶pp bp基因的組織表達分布情況。該基因在添食BmNPV病毒後,在家蠶血淋巴中大量表達,而在其他組織中表達量很低。這一表達情況與P. separata GBP BP基因的表達情況非常相似。
利用實時熒光定量PCR技術,分析了家蠶在添食BmNPV病毒48小時後與不添食情況下,血淋巴中pp bp基因的表達差異情況。從實驗結果可以得出,在添食了病毒的情況下,48小時後,血淋巴中pp bp mRNA的表達量要高於未添食病毒的參照組,幾乎成2倍的關係。利用瓊脂糖電泳驗證了擴增條帶的單一性。