第一節 差異顯示技術及其發展
一、mRNA差異顯示技術特點
mRNA差異顯示技術（differential display reverse transcriptase PCR，DDRT PCR）mRNA差異顯示技術（differential display reversetranscriptase PCR，DDRT PCR）由Liang Peng和Arthur B Pardee在1992年報道，以其操作簡便快速、靈敏度高、RNA用量少等優點在同類方法中脫穎而出，在長達10餘年的時間裏一直被廣泛使用。大多數真核生物的成熟mRNA在其3′端有一長約200個堿基的腺嘌呤多核甘酸序列，即polyA尾巴。1991年Akbar S.khan等利用mRNA這一特點設計出能與polyA配對的3′端polyT引物，同時巧妙地在引物的3′末端加上一個錨定堿基M（M代表dG/dA/dC），使引物能定位於polyA的5′末端上，並成功地將此引物用於人類腦cDNA克隆的測序上。Liang Peng（1992）等將錨定堿基增至2個，使錨定更加正確，並將其與Sam W Lee的精簡雜交技術（subtractive hybridization）結合起來建立了差異顯示技術。差示顯示技術的策略是通過一係列的錨定引物與隨機引物組合把不同種細胞或組織進行分組反轉錄與PCR擴增，這樣，極微小的基因表達差異就可被放大，通過電泳，放射自顯影得以檢測出來。其巧妙之處則在於由12種polyTMN或3種polyTM錨定引物合成的cDNA可以代表細胞中全部基因的表達種類和水平，而由引物組合所進行的PCR擴增則可將細胞之間有差異基因表達片段顯示出來。DDRT PCR技術是分離差異表達基因的一種非常有效的方法，與其他同類方法相比，DDRT PCR有以下幾個優點：一是簡便，關鍵在於PCR條件設置和測序膠電泳；二是靈敏，2μg的總RNA將可覆蓋所有的引物組合；三是可重複，90%~95%的顯示帶可穩定重複；四是效率高，可同時比較2個以上mRNA樣品；五是省時，2天可獲得mRNA顯示，在1周內完成cDNA的擴增、鑒定和克隆。此外，該方法可在每一步檢測結果，而不必等到最後才明確是否成功。
二、熒光差異顯示技術
該技術則是在DDRT PCR的基礎上，在Oligd（T） MN的5′端標記上一個熒光標記團，並在錨定引物和隨機引物的5′端加上AAGCTT的限製性酶切位點，利用熒光掃描係統精確的分辨展示的差異條帶，使實驗更為快速準確，提高了差異帶回收克隆的效率。
三、技術的局限性
DDRT PCR技術也存在其局限性。首先在於其比較高的假陽性發生率，必須步步驗證才能得到可靠的實驗結果；其次由於利用該技術所得到的差異片段靠近3′端非編碼區，對於全基因的獲得和研究這些片段的功能帶來一定的困難。
DDRT PCR自被報道以來，已陸續在引物設計、Northern blot雜交和凝膠測序等方麵得到完善和發展，產生一係列的衍生技術如RAP（RNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR）、EDD（enhanced DD）、RCDD（RFLP coupled domain directed DD）、ODD（ordered DD）、GOD（genomic DD）、兩步法、SSCP DD等。Smith（1997）、Graf（1997）、Malhotra（1999）和Buess（1997）等也分別從Northern blot雜交、PCR擴增和測序方法上對DD法進行改進。為了對稀少mRNA進行高靈敏度的顯示，Poirier等（1997）先對總RNA進行擴增，然後用擴增產物aRNA（amplified RNA）作為RT PCR模板，使靈敏度大大提高。
四、成功的事例
DDRT PCR技術自發明以來已被廣泛應用於醫學等各個學科。10多年來已經有很多相關的成功的研究報道。1992年，Liang和Pardee應用DDRT PCR技術分析了正常的和成纖維腫瘤細胞的特異性mRNA，並克隆了正常細胞中的特異性基因N1及乳腺癌特異性表達基因。Cornell大學利用DDRT PCR技術對水稻胚乳中受GA3早期誘導基因進行分析,獲得了泛素攜蛋白（vbiqution carried protein）基因和Ca2+ ATP酶基因,均為調節基因；
中國科學院遺傳與發育生物學研究所利用該技術研究鹽脅迫條件下耐鹽變異體基因的表達,克隆到了完全受鹽誘導表達的cDNA片段；張立平等利用DD PCR比較了水稻對鋁極敏感的品種PP246211和極抗品種pedel在鋁脅迫條件下基因的表達差異。王學德等利用DDRT PCR技術對水稻細胞質雄性不育與可育花藥的mRNA進行差別顯示，得到了2條可能與雄性不育有關的cDNA差異片段，分析認為可能是一些阻遏蛋白，抑製了花粉發育所必需的基因的表達。Che等應用FDD技術對水稻褐鏽病菌（Pseudomonas avenae）的相互作用的關係獲得3個差異表達的cDNA片段IAII、IAI2和IA1。
五、家蠶方麵的研究
在家蠶方麵，相對於動植物方麵的研究起步較晚。Suzuki等利用mRNA差異顯示法對家蠶編碼ETS轉錄因子類似物的基因BmEts的滯育相關表達進行了研究；劉振義等也利用差異顯示技術尋找家蠶誘導（用E.coli DH5α進行免疫誘導）前後特異表達的基因。Nanao等利用該技術從蠶卵中成功克隆到1個P450基因；Yoshiga利用該技術克隆了1個伴A酰基脫氫酶基因。梁應霞等對伴性赤蟻（sch）胚胎高溫處理獲得了mRNA溫敏性的差異表達，魯成、李斌等對家蠶腎形卵進行了mRNA差異分析。Matsunaga等2002年利用熒光差異顯示技術對家蠶蛹和成蟲翅缺失突變（fl）和野生型進行了比較研究，得到了4個基因（p40，CB10,BMCP18和AD10）在翅缺失的突變型中高表達，而另一個基因Anxb13隻在野生型中表達，突變型中沒有表達，成功地對家蠶蛹和成蟲翅缺失的機理進行了闡明。