正文 第十章 家蠶杆狀病毒Bm109基因功能(1 / 1)

第一節 Bm109基因生物信息學分析

一、Bm109的核苷酸和其編碼的氨基酸的序列特征

Bm109(orf109)全長663 bp,編碼221個氨基酸,預測分子量是25.2 kDa。其轉錄的方向和多角體轉錄方向相同。1個晚期轉錄基序ATAAG發現在ATG上遊的6nts,1個加尾信號ATTAAA發現在TAG下遊的63 nts處。通過GenBank和Swiss Prot 預測保守區和功能區,沒有發現信號肽、跨膜區和核定位信號。

二、Bm109的氨基酸同源性分析

登錄網站Swiss Port用Blast 搜索Bm109的氨基酸序列後發現,有11種杆狀病毒編碼的蛋白有Bm109的同源序列。Bm109和這些蛋白的同源性介於30%~93%之間,其中與AcMNPV的同源性高達93%。與EppoMNPV的同源性最低,隻有30%。

氨基酸序列比對用Clustal W和Cenedoc軟件。用3個陰影水平來表示它們之間的同源性高低:黑色表示100%同源,深灰色表示80%同源,淺灰色表示60%同源。

第二節 Bm109在BmN細胞中的轉錄與表達

一、Bm109的轉錄時相

從感染了BmNPV不同時間的BmN細胞中提取總RNA,進行RT PCR,顯示從感染病毒後12小時開始,樣品中出現了一條約為237 bp的條帶,該轉錄本一直持續到感染後72小時。同時,315 bp的ie1的轉錄從感染後6小時開始檢測到,直到72小時。而193 bp的p10的轉錄直到24小時才檢測到。上述結果表明Bm109可能是一個晚期基因。熒光定量PCR(QRT PCR)也反映出相應的趨勢。

二、Bm109的表達時相

為了進一步確定蛋白在感染細胞中的表達情況,收取了BmNPV感染的BmN從0小時、6小時、12小時、24小時、48小時和72小時的細胞樣品,用Bm109多克隆抗體進行Western blot分析,確定了該蛋白在病毒感染細胞中的表達時相,同時無His的Bm109蛋白作為對照。結果發現在感染後24~72小時的細胞中均有一條大小為25 kDa的特異蛋白質帶能與Bm109抗體發生特異性反應,而且大小與無His的Bm109蛋白雜交的結果一致。上述結果表明該蛋白從24小時開始可以檢測到,是一個晚期表達的蛋白。

第三節 Bm109的亞細胞定位

為了確定Bm109的亞細胞定位,用BmNPV感染BmN細胞,在感染後收集細胞,用Bm109的抗體和羊抗兔的二抗進行免疫雜交後,在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。為了確定Bm109蛋白在整個病毒感染過程中有無發生轉運,對感染後24小時、48小時、72小時收集的細胞進行了觀察,結果顯示在病毒整個侵染過程中24小時Bm109蛋白一直存在於細胞質內,48小時後Bm109大部分定位在細胞質,但在細胞核中也隱隱可見,在72小時Bm109蛋白開始出現在細胞核中。表明在感染早期Bm109定位於細胞質,到感染晚期Bm109在細胞質和細胞核中都有定位。

分別收集BmNPV的BV和ODV病毒粒子以及BmNPV感染的BmN細胞的總蛋白,用Bm109蛋白抗體對其總蛋白進行Western blot分析,結果在ODV病毒粒子的組分中發現25kDa的蛋白帶,在BV中沒有發現,而在對照BmNPV感染BmN細胞的組分中檢測到1個大小約為25 kDa的蛋白帶(使用Bm51的抗體作為BV蛋白的Western blot檢測的陽性對照)。結果表明Bm109是BmNPV病毒粒子的結構蛋白。