第一節 Bm65基因生物信息學分析
一、Bm65的核苷酸和其編碼的氨基酸的序列特征
Bm65（orf65）位於BmNPV基因組的59670~59984 nt之間，編碼104個氨基酸。預測分子量為12.2kDa。序列分析發現一個典型的早期轉錄基序TATA位於起始密碼子上遊-7~-4 nts處，預示其可能為早期基因。一個多聚腺苷酸加尾信號AATTT被發現位於終止密碼子TAA下遊+6 nts處。用SignalP 4.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析Bm65內部沒有發現信號肽。此外，用ExPASy 和 EBI 軟件分析沒有發現有修飾位點。
通過Blast比對發現Bm65高度保守。同源物位於絕大多數的鱗翅目核型多角體病毒中，相似性分別達99%~34% ，而不存在於鱗翅目顆粒體病毒、膜翅目及雙翅目核型多角體病毒中，預示著該基因可能與宿主特異性有關。同時，序列比對發現Bm65屬於GIY YIG like核酸內切酶家族的成員，目前相關功能未知。
第二節 Bm65在BmN細胞中的轉錄、表達和亞細胞定位
一、Bm65的轉錄分析
收集BmNPV感染後不同時間點的BmN細胞，提取總RNA進行RT PCR及5′RACE分析。RT PCR結果顯示從感染病毒後6小時開始，用Bm65引物能擴增得到一個大約338bp特異的DNA片段，該轉錄本持續到感染後72小時仍可檢測到，結果表明Bm65可能是一個早期基因。同時，ie1作為早期基因的對照，用ie1引物從感染後3小時的細胞樣本中開始也檢測到535bp的特異性片段，一直持續到感染後72小時。而vp39作為晚期基因對照，利用vp39引物從感染後12小時的細胞樣本中開始檢測到472bp的特異性片段，一直持續到感染後96小時。
提取BmNPV感染後24小時及48小時BmN細胞的總RNA進行5′RACE5′RACE分析，結果顯示Bm65的轉錄起始位點位於起始密碼子ATG上遊14個核苷酸處。
二、Bm65的亞細胞定位
應用免疫熒光的方法對Bm65進行亞細胞定位分析。分別收集病毒感染後24小時、48小時、72小時的BmN細胞，免疫雜交後在熒光共聚焦顯微鏡下進行觀察。結果顯示熒光在感染不同時間點細胞的細胞質和細胞核中都存在。
第三節 Bm65缺失和拯救型病毒的構建
一、Bm65基因打靶線性化片段的鑒定
以野生型BmNPV基因組DNA為模板，引物對65 US F/6 US R和65 DSF /65 DS R RCR擴增結果分別得到588bp大小的US和653bp大小的DS片段。以質粒pKOV Cm為模板用引物CmU和CmD擴增出1039bp Cm片段，電泳結果如圖593所示，擴增出的目的片段均與預期大小相符。
二、重組質粒pUC US Cm DS的酶切鑒定
將US、Cm、DS片段依次連接到pUC18載體上，構建成重組質粒pUC US Cm DS。酶切結果與預期大小一致，表明構建的pUC US Cm DS重組質粒完全正確。
三、Bm65缺失型病毒的構建和驗證
為了探討Bm65對於病毒繁殖是否必需，利用ET重組係統構建了Bm65缺失型病毒。為了不影響上下遊基因Bm64和Bm66的轉錄，Bm65中間的111bp片段被Cm取代，並用不同引物對進行PCR驗證。結果從左到右顯示用引物對Cm F/65 R從Bm65 KO中能擴增到1171bp大小片段，而以WT的bacmid為模板卻擴增不到；用引物對65 F/Cm R從Bm65 KO中能擴增到1141bp大小片段，而以WT的bacmid為模板卻擴增不到；用引物對65 F/65 R從Bm65 KO中能擴增到1246bp大小片段，而以WT的bacmid為模板擴增到334bp大小片段；用引物對65 F/65DS R從Bm65 KO中能擴增到1767bp大小片段，而以WT的bacmid為模板擴增到839bp大小片段；用引物對65US F/Cm R從Bm65 KO中能擴增到1627bp大小片段，而以WT的bacmid為模板卻擴增不到；用引物對65US F/65 R從Bm65 KO中能擴增到1759bp大小片段，而以WT的bacmid為模板擴增到831bp大小片段；用引物對65US F/65DS R從Bm65 KO中能擴增到2280bp大小片段，而以WT的bacmid為模板擴增到1352bp大小片段。表明Bm65的111bp片段成功被Cm取代。