四、Bm65 KO GP、Bm65 Rep GP和WT GP的構建
以BmNPV基因組為模板，PCR擴增得到646bp的帶自身啟動子的Bm65補回型片段，並通過酶切回收後與已構建好的pFB ieGP連接。
分別用pFB ieGP轉化WT bacmid和Bm65 KO，在轉座酶作用下發生轉座得到Bm65 KO GP、Bm WT GP，用pFB ieGP Bm65轉化Bm65 KO得到Bm65 Rep GP。通過藍白斑篩選得到白色重組子，用M13引物進行PCR驗證（圖597）。當分別以Bm65 KO GP、Bm WT GP為模板時，擴增得到含有gfp+polh+Gm的基因片段，以Bm65 KO GP為模板時擴增得到含有gfp+polh+Gm+Bm65補回的基因片段。
第四節 Bm65的功能分析
一、Bm65 KO GP、Bm WT GP 和Bm65 Rep GP在BmN細胞上的複製分析
為了進一步分析Bm65是否對病毒的繁殖有影響，分別用Bm65 KO GP、Bm WT GP和Bm65 Rep GP bacmid轉染BmN細胞。在熒光顯微鏡下觀察轉染後不同時間細胞中GFP的表達情況。結果顯示從轉染後48小時開始觀察到綠色熒光，隨著時間的延長，Bm WT GP和Bm65 Rep GP轉染的細胞中熒光量增多，到96小時，視野所見充滿了熒光。而Bm65 KO GP轉染的細胞熒光量隨著時間延長增加趨勢不明顯。分別收集轉染上清液，再次感染BmN細胞。收集不同時間點的感染上清液，進行半數組織培養感染劑量（TCID50）分析。結果顯示Bm WT GP和Bm65 Rep GP在BmN細胞中的生長趨勢沒有明顯差別，而Bm65 KO GP轉染細胞後上清液的病毒滴度不隨轉染時間的延長而增加。以上結果表明Bm65缺失後不能產生有感染性的病毒粒子。
二、病毒DNA複製分析
應用qPCR進一步分析Bm65缺失後對病毒DNA複製的影響。將純化後的BmNPV DNA 10倍稀釋成50~0.0005 ng的6個濃度，並以此為模板進行qPCR反應後製作標準曲線。分別用2.0 μg Bm WT GP,Bm65 KO GP和Bm65 Rep GP轉染BmN細胞，提取轉染後0小時、6小時、12小時、18小時、24小時、48小時和96小時總DNA，用DpnI酶去除帶入的bacmid DNA後進行qPCR分析。結果顯示3種病毒在轉染後18小時病毒DNA的增長趨勢沒有明顯差異。從轉染後24小時開始Bm65KO GP較BmWT GP和Bm65 Rep GP DNA的增長速度遠遠降低，而Bm WT GP和Bm65Rep GP之間並無顯著差別。溶解曲線顯示85℃時所有PCR產物變成單鏈。杆狀病毒通常在感染後12小時開始DNA複製，而BV在感染病毒24小時後生成釋放出來，開始新一輪的感染。圖598顯示Bm65缺失後不能產生有感染性的病毒粒子，因此Bm65KO GP和BmWT GP在轉染24小時後DNA複製速度的差異可能是由二次感染的差別所導致。故Bm65對於病毒DNA複製而言是非必需的。