（6）酶標第2抗體或酶標2抗代用品（酶標SPA）。
（7）底物液（TMB-過氧化氫尿素溶液）。底物液A（3、3′、5、5′-四甲基聯苯胺，TMB）：TMB 200mg，無水乙醇（或DMSO）100ml，加雙蒸水至1000ml。底物B緩衝液（0.1mol/L枸櫞酸-2mol/L磷酸氫二鈉緩衝液，pH5.0～5.4）：Na2HPO4 14.60g、枸櫞酸9.33g、0.75%過氧化氫尿素6.4ml，加三蒸水至1000ml，調至pH5.0～5.4。將底物液A和底物液B按1：1混合即成TMB-過氧化氫尿素應用液。
（8）底物液（OPD-H2O2溶液）：若無TMB-過氧化氫尿素溶液時可選用此係統。A液（0.1mol/L枸櫞酸溶液）：枸櫞酸19.2g，加蒸餾水至1000ml。B液（0.2mol/L Na2HPO4溶液）：Na2HPO4?12H2O2 1.7g，加蒸餾水至1000ml。臨用前取A液4.86ml與B液5.14ml混合，加入OPD 4mg，待充分溶解後加入30%（V/V）的H2O250μl，即成底物應用液。
（9）終止液（2mol/H2SO4溶液）：雙蒸水600ml，濃硫酸100ml（緩慢滴加並不斷攪拌），加雙蒸水至900ml。
【實驗步驟】
（1）將所有抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度後，加於酶標板中，100μl/孔，置濕盒內，37℃，4小時，或4℃，24小時；棄去孔中液體，控幹；
（2）加封閉液：200μl/孔，置濕盒內，37℃2小時；
（3）加洗滌液：100μl/孔，靜止，棄上清，控幹；
（4）加入待測樣品和標準抗原：將稀釋好的樣品加入酶標板反應孔中，每樣品至少加雙孔，100μl/孔，37℃溫育2小時。洗滌液洗滌3遍，每遍3分鍾；
（5）加入酶結合物：再次37℃溫育2小時。洗滌液洗滌3遍，每遍3分鍾；
（6）加入底物溶液：首選TMB-過氧化氫尿素溶液，也可用OPD-H2O2底物液係統。100μl/孔置37℃蔽光顯色。
（7）終止反應：當陽性對照出現明顯顏色變化後，加入終止液50μl/孔，終止反應，於20分鍾內用酶標儀測定光密度值定量檢測。
【結果判斷】
（1）結果的記錄方法：一般采用每孔OD值對實驗結果進行記錄，采用不同的反應底物，測定時的最大吸收峰位置不同，為得到最敏感的檢測結果，要求采用測定波長進行測定，如OPD顯色後采用492nm波長，而TMB反應產物檢測需要450nm波長，測定結果分別記錄為OD492和OD450；檢測時一定要首先進行空白孔係統調零，若空白孔出現明顯的顏色反應，或經空白孔調零後，係統檢測出現大量的負值時，整個係統測定無效；每一樣品測定雙孔的測定值應基本一致，若兩孔測定值差別較大時（具體數值根據不同測定係統的要求有所不同，一般指同一樣本相同稀釋度兩孔的OD值超過其均值的0.5～1.5倍範圍時），該樣本應重做。目前已有多種自動酶標儀能夠根據操作者的具體要求，在測定時同時完成對測定雙孔均值的計算，按已設定的判斷標準要求進行各孔的陽性或陰性結果判斷，或能夠將所測結果直接傳輸給計算機係統進行進一步處理。
（2）常用結果判斷方法
1）”比率“表示法：用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均吸收值的比值（P/N）表示，當P/N大於某一數值時（如2、2.1或3時）判斷為陽性，數值的大小依具體檢測要求而定。
2）終點”滴度“表示法：在測定時對標本進行連續稀釋，能出現陽性反應（即吸收值大於規定的吸收值）的最高稀釋度為該標本的滴度。
3）校正曲線法：在測定標本的同時，測定一組含有已知抗體含量的標準血清（通常為3～4個以上不同抗體含量血清），以吸收值為縱坐標，以抗體含量為橫坐標，可繪製一校正曲線。根據待測標本的吸收值找出相應的抗體含量，再乘以待測標本的稀釋倍數，即可得到待測樣本的抗體含量。當抗體含量超過某一數值時判斷為陽性。
4）cut-off值法：此判斷方法近年來被廣泛應用，特別是在商品化試劑盒中，由於大量的標準判斷工作已由廠商完成，簡化了使用者的判斷過程，提高了判斷的可靠性，並使不同實驗室的檢測結果具有良好的可比性。cut-off值也可在實驗室中根據具體需要建立。其基本過程是，對一特定人群（對試劑盒的應用對象有充分的代表性，並有足夠的病例數）進行檢測，獲得各測定樣品的實際OD值，同時與同一人群的金標準檢測結果（如判斷是否有相應抗體存在時用免疫印跡方法，與感染狀態有關時可用細菌培養等）作比較，確定能達到最佳診斷結果（根據具體實驗中對特異性和敏感性的不同要求確定）的OD值。在本次實驗中的對應血清為cut-off血清，此血清所含抗體濃度為係統的cut-off值。cut-off值法是在每次實驗中同時加入cut-off值血清，當待測樣品的OD大於或等於cut-off值血清的OD值時為陽性，小於cut-off值血清的OD值為陰性；也有人將cut-off值上下一定範圍（如5%～15%）作為可疑結果處理。此判斷方法的優點主要有：由於cut-off值一般位於ELISA測定時校正曲線法的線性範圍，測定誤差對結果的影響較采用陰性對照時明顯減小；應用範圍明顯擴大，在無酶標儀的條件可借助目測獲得滿意效果。
（3）不同酶標板及不同測定
批次間的結果比較：在實際工作中，經常會遇到實驗測定標本份數＞45份的情況，此時實驗不能同時在一塊酶標反應板中進行，存在不同反應板間結果如何比較的問題；有時要比較兩次不同時間進行的測定，或對兩個實驗間結果進行比較。解決此類問題一般采用兩種方法：第一種方法是在每塊酶標反應板測定時，均加入一特定抗體含量的參照標本，當參照標本測定孔吸收值達到某一數值（如0.6或1.0等）時，將所有孔的反應終止，測定中各標本孔的吸收值，此數值無需校正。第二種方法是固定作用時間的方法，即在加入底物後一定時間（如20min或30min等）終止反應，讀取參照標本和待測標本的吸收值，按下列公式計算出校正後的標本吸收值：標本校正值=待測標本吸收值/參照標本吸收值。
（二）雙抗體夾心法
【原理】
此法常用於測定多價大分子抗原，但不能用於檢測半抗原等小分子物質。將已知抗體吸附於固相載體，加入待檢標本（含相應抗原）與之結合。溫育後洗滌，加入酶標抗體和底物進行測定
【材料及試劑】