（1）酶標反應板，微量移液器，血清稀釋板，37℃孵箱，4℃冰箱和酶標儀等。
（2）包被液（pH9.6碳酸鹽緩衝液）：Na2CO30.16g、NaHCO30.29g，蒸餾水加至100ml。
（3）稀釋液（pH7.4 PBS-Tween20）：KH2PO4 0.2g，Na2HPO4?12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween20 0.5ml，蒸餾水加至1000ml。
（4）洗滌液（0.01mol/L pH7.4 Tris-HCl-Tween20）：Tris2.42，0.1mol/L HCl 13ml，Tween20 0.5ml，蒸餾水加至1000ml。
（5）底物溶液。
（6）終止液（2mol/L H2SO4）：濃H2SO422.4ml，加蒸餾水177.6ml
（7）封閉液（1%BSA pH9.6碳酸鹽緩衝液）。
【操作步驟】
（1）用包被液將已知抗體稀釋成一定濃度，加於酶標板中，100μl/孔。
（2）置濕盒內，4℃過夜。
（3）棄上清，控幹，加封閉液，200μl/孔，置濕盒內，37℃2小時。
（4）加洗滌液100μl/孔，靜止3分鍾，棄上清，控幹。
（5）重複步驟（4）2次，去除遊離的抗體。
（6）加入標準抗原和待檢樣本（視樣本不同，按一定稀釋度稀釋），100μl/孔，置濕盒內，37℃ 1小時。
（7）棄上清，控幹，重複步驟（4）3次，去除遊離的抗原。
（8）加入一定濃度的mAb，100μl/孔，置濕盒內，37℃ 1小時；若使用的抗體是酶標抗體，則步驟（9、10）省去。
（9）棄上清，控幹，重複步驟（4）3次，去除遊離的抗體。
（10）加入工作濃度的酶標二抗（羊抗鼠），100μl/孔，置濕盒內，37℃ 1小時。
（11）棄上清，控幹，重複步驟（4）3次；去除遊離的酶標抗體。
（12）加入底物溶液，100μl/孔，避光室溫反應15～20分鍾
（13）加終止液，50μl/孔，用酶聯檢測儀測定光密度值。
（三）競爭法
【原理】
此法又稱為競爭性抑製法，主要用於小分子抗原的測定，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，將特異性抗體吸附於固相載體。加入待測抗原和一定量的酶標已知抗原，使二者競爭與固相抗體結合；經過洗滌分離，最後結合於固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關
【材料及試劑】
（1）酶標反應板，微量移液器，血清稀釋板，37℃孵箱，4℃冰箱和酶標儀等。
（2）包被稀釋液（pH9.6 0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液）：Na2CO3 1.5，NaHCO3 2.9g，Na2N3 0.2g，加雙蒸水至1000ml，調至pH9.6。
（3）封閉液（5%小牛血清/PBS溶液）：小牛血清50ml，1×PBS 950ml。
（4）洗滌液（PBST，pH7.4）：NaCl 8.0g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4?12H2O 2.9g，KCl 0.2g，Tween20 0.5ml硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000ml，調至pH7.4。
（5）樣本稀釋液（PBS，pH7.4）：NaCl 8.0g，KH2PO4 0.2，Na2HPO4?12H2O 2.9g，KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000ml，調至pH7.4。
（6）酶標第2抗體或酶標第2抗體代用品（酶標SPA）。
（7）底物液（TMB-過氧化氫尿素溶液）。底物液A（3、3′5、5′－四甲基聯苯胺，TMB）：TMB200mg，無水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml。底物液B緩衝液（0.1ml/L枸櫞酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉衝液，pH5.0～5.4）：Na2HPO4 14.60g，枸櫞酸9.33g，0.75%過氧化氫尿素6.4ml，加三蒸水到1000ml，調至pH5.0～5.4。將底物液A和底物液B按1：1混合即成TMB-過氧化氫尿素應用液。
（8）底物液（OPD-H2O2溶液）：若無TMB-過氧化氫尿素應用液時可選用此係統。A液（0.1mol/L枸櫞酸溶液）：Na2HPO4?12H2O 71.7g，加蒸餾水至1000ml。B液（0.2mol/L Na2HPO4溶液）：Na2HPO4.12H2O 71.7g，加蒸餾水至1000ml。臨用前取A液4.86ml與B液5.14ml混合，加入OPD 4mg，待充分溶解後加入30%（V/V）的H2O250μl，即成底物應用液。
（9）終止液（2mol/L H2SO4溶液）：雙蒸水600ml，濃硫酸100ml（緩慢滴加並不斷攪拌），加雙蒸水至900ml。
（10）酶標記抗原：許多經常檢測的抗原成分已有商品化酶標記產品。
【實驗步驟】
（1）將純化的特異性抗體（或含有特異性抗體的抗血清）用包被稀釋液適當稀釋後包被酶標反應板，每孔100μl，4℃孵育過夜，用洗滌液洗3次，每次3分鍾。
（2）每孔加入封閉液200μl，於37℃封閉酶標反應板1小時，用洗滌液洗3次，每次3分鍾。
（3）將待測樣品適當稀釋後，每樣品至少加雙孔用於測定過程，每孔加入50μl，再加入一定濃度的酶標記抗原50μl；對照雙孔各加入酶標記抗原50μl和樣品稀釋液50μl；37℃孵育40分鍾，用洗滌液洗3次，每次3分鍾。
（4）加入底物應用液100μl，37℃蔽光顯色10～20分鍾，當對照孔出現明顯顏色反應時，每孔加入終止液50μl。
（5）於20分鍾內，用酶標儀測定各孔OD值。
【結果判斷】
（1）各測定孔顯色的深度與待測液中抗原的含量成反比，對於隻需判斷陰性或陽性結果的測定，一般按待測孔OD值與對照孔OD值的比值表示，在試驗中，當比值小於一特定數值時判斷為陽性。判斷標準比值的大小主要決定於對照孔中加入的酶標記抗原的濃度，一般通過調整酶標記抗原的濃度使判斷標準比值在0.3～0.8為宜。
（2）對於需進行精確定量測定的實驗，一般需對已知不同濃度的抗原樣品進行檢測，並根據檢測結果，按各測定孔OD值與對照孔OD值的比值繪製校正曲線。正式實驗中根據測定比值查找待測樣品的抗原含量。