（二）聚丙烯酰胺垂直平板電泳
1.原理電泳原理、試劑和圓盤電泳類同，僅電泳槽和製備凝膠板形式上有了變化。它具有凝膠電泳的一般優點，同時要將檢樣分離後的標本製成膠片，供攝影、繪畫、掃描、對照觀察並可長期保存。還可將同一塊凝膠上進行多份檢樣對照分離和差異分析。
2.材料和試劑
（1）電泳儀一套。DYY-Ⅲ9型電泳儀和DYY-Ⅲ23型電泳槽。
（2）垂直平板倒板裝置。國產電泳儀不配置這種設備，製備凝膠板是分析樣品的重要一步，作者根據平板物質與要求，專門設計一種自製有機玻璃倒板裝置，使用靈活，成功率達100％。
3.方法
（1）製板：取10cm×13cm玻璃（或電泳槽配置的玻板）兩塊，板間邊緣隔一層橡皮圈或細膠皮管，大小與玻璃板相同，橡皮厚度其規格有0.1、0.15、0.3cm；寬0.5～0.8cm不等。將潔淨玻板置於倒板架上，擰緊螺絲固定。取配製好的凝膠（配製濃度與方法按圓盤電泳技術）倒入兩板間，迅速安裝橡皮梭或有機玻璃梭齒，水封待凝。
（2）加樣：凝膠膠體形成後，取下梭齒吸棄（盡）水層，每孔加血清（被檢樣品）2～3μl，沿玻板壁加入緩衝溶液封口。
（3）電泳：擰鬆倒板架鏍絲，取下凝膠樣品玻板，撤下底邊緣橡皮，移入垂直電泳槽一側，一邊靠緊上槽，另一邊置於電泳下槽，兩槽倒入適宜緩衝液，玻璃凝膠板上端與上槽沿用四層濾紙或直接與緩衝溶液搭橋相接。啟開電源，每次可對放兩塊凝膠玻板，每塊所需電流24～26mA，電壓260～300V，以mA為主，電泳100～120分鍾，或視電泳指示帶移於凝膠板底部1.0cm處，停止電泳，關閉電源。
（4）染色：取下電泳凝膠板，輕輕撥動兩塊玻板，板間即可鬆動，取出電泳凝膠移入氨基黑10B染液中，浸染8～10分鍾，脫色用配比冰醋酸：無水乙醇：水＝5：10：85中進行洗膠，少量多次洗漂效果更好，隻至膠底板清晰為止，需1～112天，37℃加溫洗脫可行。
（5）製片：洗脫清晰的樣品凝膠，輕輕回複一塊玻璃板上，蓋上一層清淨玻璃紙。反轉膠麵，再覆上一層玻璃紙，以玻板為襯墊，四周用夾子固定。於室溫或45～50℃溫箱中（有抽濕裝置為好）放置過夜即成透明膠片。有學者采用配比酒精脫水方法進行也是可行的，隻是手續繁雜，浪費嚴重。製得的膠片可在觀片燈前查閱記錄，或掃描記錄保存，或直接剪成膠條於改製的光電比色計上讀數，繪製曲線峰相對定量分析。
4.注意事項
（1）製板要嚴緊均一，不能有疏漏的地方，凝膠板中切忌氣泡，每板必須有對照標樣。
（2）電泳中兩塊凝膠板同時進行時，電流過大產熱可能影響或破壞生物樣品，可將電泳槽移置於4℃環境中進行。
（3）板式電泳可根據實驗目的要求，自行設計多樣的板或槽供實驗研究與臨床診斷分析。有機玻璃為我們製作提供了可靠可行的材料。
（林燕萍）
第五節 固相酶免疫測定方法
固相酶免疫測定技術是屬於免疫酶技術中的一種。根據實際應用目的，免疫酶技術可分為免疫酶組織化學技術和酶免疫測定兩大類。前者已在第三節中具體闡述，後者按照抗原抗體反應後，是否需要分離遊離的和與抗原或抗體結合的酶標記物，又分為非均相酶免疫測定和均相酶免測定兩種類型，簡要概括如下：
免疫酶技術
免疫酶組織化學技術
酶免疫測定
均相酶免疫測定
非均相酶免疫測定
固相酶免疫測定（ELISA）
液相酶免疫測定
應用酶標抗體進行免疫測定的方法較多，非均相酶免疫測定是目前應用最廣泛的一類免疫檢測技術，試驗原理與放射免疫測定相似。在抗原抗體反應達到平衡後，需采用適當的方法將遊離的和已與抗原（或抗體）結合的酶標記物加以分離，再通過酶催化底物顯色進行測定。根據試驗中是否使用固相支持物作為吸附抗體或抗原的載體，又分為固相酶免疫測定和液相酶免疫測定兩種類型。
固相酶免疫測定如同固相RIA一樣，將抗原或抗體吸附在固相支持物上，使免疫反應在固相載體上進行。然後借助於特異結合的酶標抗體催化底物生成有色產物，借以測定抗原或抗體的含量。根據固相支持物不同，SPEIA分為用瓊脂脂糖珠作為載體的限量抗原底物珠體係，和用聚苯乙烯及其他固相支持物的反應體的酶聯免疫吸附試驗兩大類。DASS法現已較少使用，以下著重介紹ELISA法。
一、ELISA的基本原理
1971年瑞典學者Engvall和Perlmann，荷蘭學者Van Weeman和Schuurs分別報道將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。其基本原理與RIA相同。先將已知的抗體或抗原結合在某種固相載體上，並保持其免疫活性。測定時，將待檢標本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表麵吸附的抗體或抗原發生反應。用洗滌的方法分離抗原抗體複合物和遊離成分。然後加入酶的作用底物催化顯色，進行定性或定量測定。
二、方法類型
ELISA可用於測定抗體，也可用於檢測抗原。根據檢測目的和操作步驟不同，有間接法、雙抗體夾心法和競爭法等3種常用類型。
（一）間接法
【原理】
酶聯免疫吸附實驗間接法是酶聯免疫吸附實驗中最常用的方法之一，用於對各種抗體的檢測。將已知抗原吸附於固相載體，加入待檢標本（含相應抗體）與之結合。洗滌後，加入酶標抗球蛋白抗體（酶標抗抗體）和底物進行測定。
【材料及試劑】
（1）酶標反應板，微量移液器，血清稀釋板，37℃孵箱，4℃冰箱和酶標儀等。
（2）包被稀釋液（0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液，pH9.6）：Na2CO31.5g、NaHCO3 2.9g、Na2N3 0.2g加雙蒸水至1000ml，調至pH9.6。
（3）封閉液（5%小牛血清/PBS溶液）：小牛血清50ml，1×PBS（Ph7.4）950ml。
（4）洗滌液（PBST，pH7.4）：NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4?12 H2O 2.9g、KCl 0.2g、Tween20 0.5ml、硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000ml，調至pH7.4。
（5）樣本稀釋液（PBS，pH7.4）：NaCl 8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4?12 H2O 2.9g、KCl 0.2g、硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000ml，調至pH7.4。