在SDS-PAGE之後，利用電泳將蛋白質從凝膠中轉印到硝酸纖維素濾膜上，在轉印過程中，各個蛋白條帶的相對位置保持不變。在電泳轉印之後，將靶蛋白的特異性抗體（未標記）作用於濾膜，結合的抗體可以通過下列幾種第二免疫試劑進行檢測：125I-標記的蛋白A或抗免疫球蛋白，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的抗免疫球蛋白或蛋白A，或生物素標記的抗免疫球蛋白（然後再用酶連親和素進行檢測）。采用Western blotting方法可以檢測到1～5ng的蛋白質。
（二）主要儀器、材料和試劑
1.主要儀器和材料垂直幹板電泳槽、轉移電泳槽、恒壓電泳儀、低電壓大電流電泳儀、搖擺平台、熱封口器、磁力攪拌器、150ml三角瓶、200ml量筒或1000ml量筒、玻璃試管、滴管、玻棒、注射器、50μl微量注射器、Eppendorf管、Tip頭、如衛生紙、硝酸纖維濾素膜、搪瓷盤、塑料手套、微量加樣器0～20μl，0～200μl，0～1000μl。
誘導後的工程菌，或基因轉染細胞的培養上清。
2.試劑SDS-PAGE加樣緩衝液、5×SDS-PAFE電泳緩衝液、考馬斯亮藍固定染色液、脫色液ⅠⅡ、轉移緩衝液（SDS-PAGE 1×電泳緩衝液，含20%甲醇）、麗春紅染液、脫脂奶粉、NaN3、Tris緩衝鹽溶液（TBS）：20mmol/L Tris／HCl（pH7.5），500mmol／L NaCl、Tween20、針對待檢蛋白質的第一抗體、堿性磷酸酶標記的第二抗體、30％丙烯酰胺溶液（30%arc/bis）、10％SDS溶液、分離膠緩衝液［1.5mmol/L Tris-HCl（pH8.8）］、濃縮膠緩衝液［0.5mmol/L Tris-HCl（pH6.8）］、TEMED、10％過硫酸銨溶液（臨用前配製）、NBT（溶於70％二甲基甲酰胺，75mg／ml）、BCIP（溶於100％二甲基甲酰胺，50mg／ml）、100mmol／L Tris-HCl（pH9.5），100mmol／L NaCl、20mmol／L Tris-HCl（pH8.0），5mmol／L EDTA。
（三）操作步驟
1.凝膠前的準備
（1）從盛有洗潔精溶液的容器中取出長短不一的兩塊玻板，用自來水洗淨後，用蒸餾水衝洗一次，置37℃溫箱烘幹。不要用手直接接觸玻璃，戴塑料手套進行操作。
（2）將玻板安裝在密封墊上，嵌入相應的玻板槽內，形成玻板夾心製膠模。將玻板夾心安在電泳槽的兩極之間，較短的玻板須對著帶有黑色插座的部分（負極）。擰緊螺絲，固定電泳槽。
2.凝膠的配置
（1）在試管中配製封底膠溶液：
蒸餾水0.1ml0.3ml0.5ml
10%過硫酸銨0.1ml0.3ml0.5ml
TEMED2μl6μl10μl
總體積1ml3ml5ml
（2）用滴管取膠溶液，從玻板夾心的外部將膠溶液加到玻板夾心的底部。置室溫5～10分鍾。將梳子插入玻板夾心，用記號筆在玻板上畫一條線，距梳齒15mm。然後取出梳子。
（3）在三角瓶內配製15ml分離膠溶液：
3.灌膠
（1）用滴管取膠溶液灌入玻板夾心，直到高出標記線2mm左右。緊接著用滴管將蒸餾水小心加在膠溶液的上麵，不要打動界麵，避免水與膠溶液混合。然後將電泳槽內加入自來水至短玻板的頂部，以防所灌的膠外漏。置室溫過夜。
（2）將分離膠上麵的水倒掉，把電泳槽傾斜放置，讓剩餘的水流出。同時，在三角瓶內配製7.5ml 4％濃縮膠溶液（1ml 30％arc／bis、1.9ml濃縮膠緩衝液（pH6.8、75μl 10％SDS 4.55ml蒸餾水、75μl 10％過硫酸銨、7.5μl TEMED）
（3）把梳子插入兩玻板之間。用滴管取膠溶液加入玻板之間，直至加到短玻板的上端。然後將電泳槽內加入自來水至短玻板的頂部，以防所灌的膠外漏。置室溫2～3小時。
4.上樣
（1）製備SDS-PAGE樣品：從冰箱取出凍存的蛋白質樣品（或菌體），溶解後加等體積的SDS-PAGE加樣緩衝液，在混勻器上振蕩20秒鍾。置水浴煮沸5分鍾。
（2）小心拔出梳子，須將梳子垂直拔出。如果膠齒不直，可用注射器針頭將膠齒拔直。用蒸餾水輕輕衝洗加樣孔，然後將水再甩淨。
（3）將電泳槽加入0.5×電泳緩衝液。電泳緩衝液要蓋住短玻板的上端。
（4）用微量注射器取SDS-PAGE蛋白質樣品按照預定的順序加入加樣孔，每孔20μl，樣品須加到加樣孔的底部。
5.電泳
（1）將電泳槽與恒壓電泳儀連接，以紅電線連接紅插座（正極），黑電線連接黑插座（負極）。仔細檢查是否所有部位都已正確連接。然後接通電源，打開電泳儀。調整電流到20mA。幾分鍾後，見溴酚藍向下遷移。繼續電泳直至溴酚藍遷移到凝膠的下端。
（2）將電壓調到零，再關閉電源。倒掉電泳緩衝液。
（3）用自來水衝洗電泳槽，鬆開螺絲，將電泳槽的兩部分分開。從密封墊上取下玻板。小心將玻璃板撬開，膠會粘在其中一塊玻板上。在靠近左邊第一個加樣孔處將凝膠切去一個角，標定凝膠的方位。
（4）如果凝膠不用於Western印跡及顯色，可將凝膠進行固定和考馬斯亮藍染色。用考馬斯亮藍染液將膠塊從玻板上洗下，浸泡在染液中過夜。
（5）回收染液，加入脫色液Ⅰ1～2小時後，再換脫色液Ⅱ繼續脫色。觀察實驗結果。也可拍攝照片保留實驗結果。
6.轉移蛋白質至硝酸纖維素濾膜
（1）戴上塑料手套，將硝酸纖維素濾膜剪成與凝膠同樣大小。用軟芯鉛筆在下角做好記號。
（2）將硝酸纖維濾膜浮於蒸餾水麵，讓其從下麵自然浸濕。浸入蒸餾水中10～30分鍾。再浸泡在轉移緩衝液中2～4小時。
（3）在一搪瓷盤內加入轉移緩衝液（SDS-PAGEl×電泳緩衝液，含20％甲醇），放入一塊塑料框架，浸入緩衝液內。依次放上一塊海綿，一張濾紙，凝膠，硝酸纖維素濾膜，一張濾紙，一塊海綿，最後以適當方式將兩個框架固定好。每加一層都要注意用玻棒趕走氣泡。在有氣泡處，蛋白質不能轉移至濾膜。
（4）將框架放入轉移電泳槽內，硝酸纖維素濾膜在正極一側，倒滿轉移緩衝液。接上導線。接通電源，恒流380mA，電泳30分鍾。
（5）停止電泳。從上至下拆開轉移裝置，一層一層揭去。將硝酸纖維素濾膜轉入麗春紅染液（用蒸餾水將原液按1：50稀釋）中染色10～30分鍾。
（6）用蒸餾水稍事漂洗。用注射器針頭在濾膜上刺幾個小孔，標出條帶的位置。