（3）輕輕倒出固定液，將組織於4℃在蔗糖溶液（DEPC處理的PBS，含30％蔗糖）中浸泡過夜。在這一步驟中，組織應沉到容器的底部。將組織貯存在-80℃，若要長期保存，則貯存在-140℃。
（4）進行切片時，將樣品升溫至-20℃，在低溫恒溫器中切成10μm厚的切片。
（5）將切片放在預先處理好的玻璃載玻片上。將載玻片置40℃烤箱過夜烘幹。立即使用這些玻片。或將其存放在一個盒子內置於-80℃。臨用前使其升溫至室溫，再放入40℃烤箱幹燥2小時以上。
石蠟切片
（1）按照有關的標準程序製備甲醛固定並用石蠟包埋的材料。
（2）從石蠟包埋的材料切取？1μm厚的切片，置於包被好的玻璃載玻片上。將載玻片置40℃烤箱過夜烘幹。在二甲苯中浸泡脫蠟，2×10分鍾。
（3）在下列溶液中將切片脫水：100％乙醇，1×5分鍾；95％乙醇，1×5分鍾；70％乙醇，1×5分鍾。
（4）DEPC處理的雙蒸水，2×5分鍾。
3.用地高辛標記適當的DNA探針。
4.預雜交
（1）將切片浸泡於DEPC處理的PBS（pH7.4），2×5分鍾；然後再浸泡於含100mmol/L甘氨酸的PBS（DEPC處理），2×5分鍾。
（2）用含0.3％Triton X-100的PBS（DEPC處理）處理切片，15分鍾。用PBS（DEPC處理）洗滌，2×5分鍾。
（3）用含11g／ml無RNA酶的蛋白酶K（用於冷凍切片）或5～20μg／ml無RNA酶的蛋白酶K（用於石蠟切片）的TE緩衝液在37℃處理切片30分鍾，增加通透性。
（4）用含4％多聚甲醛的PBS（DEPC處理）在4℃處理5分鍾，對切片再進行固定。
（5）用PBS（DEPC處理）洗切片，2×5分鍾。將切片盒置於搖擺平台上，將切片浸泡於0.1mol／LTEA緩衝液（pH8.0，含0.25％乙酸酐）中，2×5分鍾，使切片乙酰化。
（6）將預雜交液（4×SSC，50％去離子甲酰胺）加在載玻片上，置37℃10分鍾以上。
5.原位雜交
（1）製備雜交液：40％去離子甲酰胺，10％葡聚糖硫酸酯，1×Dehardt's試劑，4×SSC，10mmol／L DTT，1mg／ml yeast tRNA，1mg／ml變性的鮭精DNA。
（2）倒去載玻片上的預雜交液，每塊載玻片上加30μl雜交液（含5～10ng DIG標記的DNA探針）。
（3）用24mm×30mm的疏水塑料蓋玻片蓋住樣品。
（4）在一個濕盒內置42℃將切片溫育過夜。
6.雜交後的洗滌
（1）將載玻片浸入2×SSC 5～10分鍾，去掉蓋玻片。
（2）在37℃水浴搖床內洗滌載玻片：2×SSC 2×15分鍾、1×SSC 2×15分鍾、0.1×SSC 2×30分鍾。
7.免疫結果的檢測
（1）在搖擺平台上，用buffer 1100mmol／L Tris-HCl（pH7.5），150mmol/L NaCl洗滌載玻片，2×10分鍾。
（2）將封閉液（buffer 1，含0.1％Triton X-100，2％正常羊血清）加到切片上，孵育30分鍾。輕輕倒去封閉液，將含有1％Triton X-100，1％正常羊血清和適當稀釋的抗DIC-AP的buffer 1加到切片上，在濕盒內溫育2小時。
（3）用搖擺平台，以buffer 1洗切片，2×10分鍾。將切片在buffer 2［100mmol／L Tris-HCl（pH9.5），100mmol／L NaCl，50mmol／LMgCl2］中溫育10分鍾。
（4）製備顯色液：10ml buffer 2，加入45μl NBT（75mg／ml）溶液，35μl BCIP（50mg／ml）溶液，10μl levamisole（1mol／L）。
（5）將200μl顯色液加到切片上，將載玻片置於濕盒內，在黑暗處，溫育2～24小時。
（6）當顯色至適當顏色時，將載玻片浸入buffer 3 10mmol/L Tris-HCl（pH8.1），1mmol／L EDTA，停止顯色反應。
（7）將載玻片浸泡在蒸餾水中。將切片再用適當的細胞染色液（如核固紅等）進行襯染。用水漂洗，2×10分鍾。
（8）用水溶性封固劑（如甘油等）封片。
第四節 蛋白質檢測方法
蛋白質的檢測方法主要有三種，分別是蛋白質印跡法、免疫組織化學法和酶聯免疫吸附測定。分子生物學常用的方法是蛋白質印跡法。這種方法類似於RNA印跡檢測mRNA的方法。從組織或細胞中提取的目的可溶性蛋白質經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS/PAGE）分離。在電泳時凝膠中的SDS與蛋白質向陽極遷移，蛋白質按分子量、結構和電荷所決定的電泳動性不同而被分開。像DNA和RNA印跡一樣，凝膠上的蛋白質可以被轉印到硝酸纖維素濾膜上。先用一個蛋白質混合液孵育濾膜，洗去非結合抗體後，再用抗體的抗體（第二抗體，來源於不同種動物，比如羊抗兔）和任何一個像原位雜交一樣的檢測係統相結合進行檢測。第二抗體既可以與酶連接介導化學反應出現有色沉澱產物，也可以與放射活性物或化學發光贅生物連接，它們將在X線片上曝光或激發熒光而被檢測出結果。在提取物蛋白質泳道加上已知分子量的標準蛋白質，就可以由已知標準而檢測出提取物中目的蛋白質的分子量。下麵就具體介紹免疫印跡的實驗方法。
免疫印跡法——WesternBlot
（一）原理
Western Blotting是將蛋白質轉移並固定在化學合成膜的支撐物上，然後以特定的親相反應、免疫反應或結合反應以及顯色係統分析此印跡。這種以高強力形成印跡的方法被稱為WesternBlot技術。免疫印跡法包含有三項內容，即SDS－PAGE（SDS－聚丙烯酰胺）凝膠電泳、蛋白質由凝膠轉印至硝酸纖維素濾膜和固相免疫測定。
十二烷基磺酸鈉（SDS）可以牢固地結合於蛋白質，使其呈杆狀的形態。大多數蛋白質都可以同樣的比例結合SDS，每克蛋白結合1.4g SDS，SDS分子對氨基酸殘基的比例大約為1：2。大量的SDS所具有的負電荷可以遮掩蛋白質本身的電荷，因而經SDS處理的蛋白質幾乎都帶有同樣的電荷／質量比和相似的形狀。因此，蛋白質在含有SDS的凝膠中時是按照分子量的大小得以分離的。蛋白質在此種凝膠中的相對遷移率與其分子量的對數呈線性關係。有許多蛋白質不隻一條多肽鏈，SDS處理可以破壞亞基之間的非共價連接。另一方麵，巰基乙醇常用來將連接亞基的二硫鍵還原。因此，SDS-PAGE所產生的條帶都是亞基的條帶，而不是完整的蛋白質。