7.免疫印跡的顯色
所有的步驟都在塑料袋裏進行，用熱封口器封口。加底物溫育時必須用一個新袋。
（1）配製封閉液：稱取脫脂奶粉和NaN3，加入TBS中，奶粉的終濃度為1％，NaN3的終濃度為0.05％。置磁力攪拌器攪拌直至奶粉溶解為止（約20～30分鍾）。
（2）將結合有蛋白質的硝酸纖維素濾膜放入塑料袋中，加入封閉液，用熱封口器封口。於室溫（20～26℃）置搖擺子台過夜，封閉硝酸纖維素濾膜。用含0.05％Tween 20的TBS洗硝酸纖維素濾膜，2×20分鍾，於室溫平緩搖動。
（3）用TBS Tween稀釋第一抗體。每種抗體的最佳稀釋度須預先確定。將硝酸纖維素濾膜與第一抗體置37℃水浴搖床溫育2小時。用含0.05％Tween 20的TBS洗硝酸纖維素濾膜，2×20分鍾，於室溫平緩搖動。
（4）用TBS Tween稀釋堿性磷酸酶標記的第二抗體。最佳稀釋亦須預先確定。與硝酸纖維素濾膜在37℃水浴搖床溫育1小時。用TBS洗硝酸纖維素濾膜，3×20分鍾，於室溫平緩搖動。
（5）加45μl NBT溶液和35μl BCIP溶液到10ml 100mmol/L Tris-HCl（pH9.5），100mmol／L NaCl中，製成底物溶液。避光並在1小時內使用。
（6）將硝酸纖維素濾膜移入一新袋（避光），加入底物置室溫溫育，直至在蛋白條帶處形成紫色沉澱或背景剛剛開始變紫為止。在背景顏色加深之前應停止反應。如果底物溶液變紫應立即將溶液倒掉，用TBS－Tween漂洗濾膜，再加新鮮的底物溶液。
（7）用20mmol/L Tris-HCl（pH8.0），5mmol／L EDTA替換底物溶液，終止反應。當濾膜濕潤時，顏色較深；而硝酸纖維素濾膜放幹後，背景會變淺。
第五節 聚合酶鏈反應（PCR）技術
聚合酶鏈反應（PCR）是分子生物學繼克隆和DNA測序後的第三個主要的技術進步。PCR是一個酶催化的DNA序列的擴增反應。可使原DNA序列增多至1個以上，由此可得到足夠量的特異DNA片段用於進一步的研究和分析。人類基因組估計有10萬個基因，總共60億個堿基。PCR生產短片段DNA的能力省去了傳統的篩選過程，使分子生物學技術發生了革命性的進步。PCR技術於1988年開發，其原理是溫度依賴的引物與模板的雜交、聚合，隨後新合成的雙鏈DNA的變性和新一輪的聚合，結果使基因組中的靶DNA得到擴增。
PCR由於Taq聚合酶的出現變得更為實用。Taq酶是個熱穩定酶，來源於居住在熱溫泉邊的熱耐受細菌。許多類似的熱穩定聚合酶已被相繼地開發出來。熱穩定DNA聚合酶被用於PCR，使DNA序列的擴增可在熱循環條件下進行。一個DNA模板和2個引物（一般15～30個堿基）以及核苷酸和Taq聚合酶共同孵育。引物與靶序列互補，靶序列的其餘部分就被擴增。在低溫（通常50～60℃）下，引物退火混合液被加熱到適宜的溫度（一般為72℃）使聚合酶充填到DNA模板上，從引物開始生產出一個雙鏈DNA，然後混合液又升高到92～94℃，使已經產生的DNA雙鏈變性，結果出現2條互補的模板鏈。這種熱循環被再重複，結果原始模板序列得到了幾何學（指數式）的擴增。
PCR反應產物可以在瓊脂糖電泳後經EtBr/UV照相而顯示。對於低水平DNA，標記的核苷酸可加入到PCR反應液中，凝膠經轉印後放射性自顯影可增加檢測的敏感性。標準分子量可以用來證實擴增片段的長度。產物片段也可從凝膠上提取出來再次擴增並可被克隆入載體進一步地處理或測序。PCR的引物中可以設計插入限製性酶切位點，方便擴增的片段克隆入適當的載體。準確而又特異的PCR擴增可以用巢式引物來提高其特異性，第二對特異引物的序列位於靶序列第一對引物的內部，經過第一對引物的初始擴增後，進而用第二對內引物對初次擴增再擴增。
反轉錄PCR（RT－PCR）是指擴增從RNA而不是從DNA起始。第一步是用反轉錄酶將原始RNA模板轉錄為cDNA。RT－PCR最常用於mRNA序列的擴增中，並且可定量地檢測極低水平的mRNA信號。從PCR凝膠上帶的亮度就可估計cDNA的相對水平，但是在PCR反應中，模板DNA數量的微小差異，反應管中的溫度不同和其他可變性因素都會產生非常大的擴增結果的誤差。
用PCR擴增DNA片段的反應中，經過多次循環後（大於20～25次擴增循環，根據模板數量和反應條件而定）PCR產物就變為非線性反應。在理論上，比較PCR產物量的多少應在反應曲線的線性部分（在擴增低循環次數中），這樣就可對每個反應管中原始材料中的模板數量進行定量。但是因為如上述所提到的實驗可變性，所以定量的結果不是非常準確。這些定量比較在用PCR從目的mRNA擴增cDNA為手段去研究基因調控中扮演著重要的角色。現在，已經有幾個增加PCR定量準確性的方法出現，其中一個是競爭性PCR，用一個已知數量的模仿序列（一個與靶序列長度相似的序列）製備一個模仿序列的係列性（已知濃度）稀釋反應管，同樣稀釋模板序列。根據這個係列設置的原理，在模仿序列DNA最稀釋的管中含有的未知DNA的濃度最高，反之亦然。將聚合酶與模仿序列3′和5′互補的引物以及與靶序列互補的序列共同加入反應混合液中。其原理是當PCR循環時靶模板和模仿序列一致性地被放大，因此當PCR產物跑膠時在每個泳道上有兩條帶，並與模板的最初總量成正比。比較兩條帶的相應亮度，就可從兩條帶的亮度幾乎相等的那個泳道上估計出實際初始模板的數量。這個技術的一個變形方法是用熒光贅生物標記核苷酸，這些熒光贅生物平時不發光，隻有核苷酸被聚合酶加到DNA鏈上時才釋放熒光。因此溶液中熒光的數量與DNA的合成量成比例。當擴增反應時用計算機對多個平行反應管同時監控熒光信號，同時也對一個標準反應管準確定量，就可以對PCR反應物的產物進行定量。
PCR的另一個重要應用是克隆新基因。例如，如果一個蛋白質的部分序列可通過氨基酸分析儀而得知，就可以用PCR克隆這個基因。可以合成從氨基酸序列而來的兼並DNA引物（對於特定的氨基酸，在每一個密碼位置上都使用了所有可能的密碼組合），這個DNA引物編碼這個蛋白質的一個片段的氨基酸序列。從靶種或靶組織中獲得的基因組DNA或cDNA用簡並引物混合及擴增。靶DNA序列就會被正確互補配對的引物選擇性地擴增出來。這個片段在合成時可被放射性標記，或克隆入一個載體，隨後標記，就可用它作為一個探針篩選適宜的基因組或cDNA文庫。因此，包含所有或部分基因的DNA或mRNA的序列就可以被分離和加工處理，或進一步研究。