(5)在一個塑料盒或塑料袋中洗滌濾膜,不斷搖動:依次加入250ml 2×SSC/1%SDS和1×SSC/0.5%SDS,分別在室溫下洗15分鍾,再加依次加入250ml 0.2×SSC/0.1%SDS和0.1×SSC/0.1%SDS,分別於68℃洗30分鍾。洗滌後,用手提式監測器測定濾膜的放射性。
4.雜交結果的檢測
(1)室溫下將濾膜在0.1×SSC中漂洗片刻,然後將其放在一疊紙巾上,除去液體後再將其放在一張塑料薄膜上,用以放射性墨水製作的黏性圓點標簽在塑料膜上標幾個不對稱的點,以便以後校準放射自顯影片與濾膜的位置。
(2)用另一張塑料薄膜蓋住濾膜,將濾膜裝入帶有增感屏的曝光暗盒內。在暗室內,將一張X線底片放入曝光暗盒,使之接觸濾膜。將暗盒置-70℃冰箱,使濾膜對X線底片曝光1~7天。
(3)將暗盒從冰箱中取出,置室溫1~2小時,然後衝洗X線片。
三、Northern印跡法
(一)原理
Northern印跡是指將RNA變性及電泳分離後,將其轉移到固相支持物上的過程,從而用於雜交反應以鑒定其中待定mRNA分子的大小與含量。基本原理與
Southern印跡相同,但Northern印跡雜交技術也有如下特點:①Northern印跡雜交技術檢測的是RNA,可特異性的對mRNA進行定性、定量分析,並確定其分子量大小。因RNA極易被環境中存在的RNA酶破壞,因此,在提取RNA時一定要除盡RNA酶。②RNA電泳一定要在變性凝膠中進行,在凝膠中加入乙二醛、甲醛等變性劑,防止RNA分子二級結構的形成,維持其在凝膠中的線性狀態。③電泳結束後,凝膠不需要進行變性的中和,直接進行凝膠中RNA的轉膜,即Northern印跡。
(二)主要儀器、材料和試劑
1.主要儀器和材料手提式紫外燈、手提式監測器、電泳儀、電泳槽、照相設備、熱封口器、水浴箱、真空烤箱、Eppendorf管若幹、Tip頭若幹、搪瓷盤、鑷子、剪刀、塑料手套、解剖刀、新華2號濾紙、衛生紙、玻璃板、硝酸纖維素濾膜(0.45μm)、塑料袋、塑料薄膜、X光底片、增感屏、曝光暗盒。
從哺乳類細胞提取的總RNA、32P-DNA探針
2.試劑1mg/ml溴化乙錠(用重蒸水從10mg/ml貯存液稀釋、20×SSC、10×SSC、6×SSC、2×SSC,1%SDS、1×SSC,0.5%SDS、0.2×SSC,0.1%SDS瓊脂糖、5×甲醛凝膠、電泳緩衝液、甲醛、加樣緩衝液(用於RNA凝膠電泳)、甲酰胺、50×Denhardt's試劑、20×SSPE、50%葡聚糖硫酸酯、300mg/ml肝素、10mg/ml鮭精DNA。
(三)操作步驟
1.RNA電泳
(1)將瓊脂糖在微波爐或沸水浴中溶解,然後將溶液冷卻至50~60℃。然後再將瓊脂糖溶液加入到1×甲醛凝膠電泳緩衝液(pH6.9~7.0)中,至終濃度1%。將37%甲醛溶液(12.33mol/L)加入到凝膠溶液中,至終濃度0.32mol/L,倒入已用膠帶封住邊緣的製膠盤中,放好梳子,凝膠凝固1小時後即可使用。
(2)在Eppendorf管中,將RNA樣品(用高壓滅菌水適當稀釋)與等體積的加樣緩衝液混合,總體積約為加樣孔體積的80%。再將混合後的樣品置沸水浴2~4分鍾,然後置冰上冷卻2分鍾,使RNA變性,離心5秒鍾(12000r/min)。
(3)每管加入1.2μl 1mg/ml溴化乙錠。將樣品加入凝膠的點樣孔內。凝膠於1×甲醛凝膠電泳緩衝液內,以5V/cm的電壓在室溫進行電泳,直到溴酚藍移動約8cm。
2.轉膜(毛細管轉移法)
(1)電泳完畢後,將一透明尺放在凝膠旁,在紫外燈下拍照。在凝膠左上角切去一角(加樣孔一端為上)。將一張濾紙放在一疊玻璃板上,形成一個長和寬均大於凝膠的支撐平台,將其放入搪瓷盤內。倒入20×SSC溶液。當平台上方的濾紙濕透後,用玻璃棒趕出所有氣泡。
(2)取一張硝酸纖維素濾膜,剪去一角,使之與凝膠上的切角相對應。將濾膜浮在高壓滅菌水表麵,直至濾膜從下向上濕透,隨後將濾膜在10×SSC中浸泡至少5分鍾。
(3)將凝膠翻轉倒置在平台上,用玻璃棒趕出所有氣泡。用塑料薄膜圍繞凝膠周邊。將濕潤的硝酸纖維素濾膜放置在凝膠上(注意應使兩者的切角相重疊。濾膜的一條邊緣應剛好超過凝膠上部的加樣孔邊緣。濾膜置於凝膠表麵後就不應移動),用玻璃棒趕出所有氣泡。
(4)將兩張與凝膠一樣大小的濾紙在20×SSC溶液中浸濕,將其放在濕潤的硝酸纖維素濾膜上,用玻璃棒趕出所有氣泡。將一疊略小於濾紙的紙巾放在濾紙之上,並在紙巾上放一塊玻璃板,然後用一個500g的重物壓實,使RNA轉移過夜。
(5)轉移完畢後,除去凝膠上的紙巾和濾紙,翻轉凝膠和硝酸纖維素濾膜,將凝膠在上置於一張幹的濾紙上。用軟芯鉛筆或圓珠筆在濾膜上標記凝膠加樣孔的位置。將凝膠從硝酸纖維素濾膜上剝除。將濾膜在6×SSC溶液中漂洗後放在紙巾上,室溫下幹燥30分鍾。
(6)濾膜晾幹後置於兩張濾紙中間,放在80℃真空烤箱中幹烤2小時即可用於雜交。
3.Northern雜交
(1)配製預雜交液:每平方厘米硝酸纖維素濾膜大約需要0.15ml預雜交液(預雜交液:6.5%葡聚糖硫酸酯、1%十二烷基肌穀氨酸鈉、50%甲酰胺、5×Denhardt's試劑、5×SSPE、500μg/ml肝素、鮭精DNA在變性後加入)。
(2)將預雜交液先預熱至42℃後加入塑料袋,將表麵帶有目的RNA的硝酸纖維素濾膜放入稍寬於濾膜的塑料袋,用5×SSPE將濾膜浸濕5分鍾。將鮭精DNA置沸水浴10分鍾,然後置冰上冷卻1~2分鍾,使DNA充分變性。
(3)將5×SSPE從塑料袋中除去後加入預雜交液,按每平方厘米濾膜加20μl鮭精DNA,至終濃度200μg/ml。應盡可能除淨袋中的空氣。用熱封口器封住袋口,將其置42℃水浴保溫4小時。
(4)將標記的DNA探針置沸水浴10分鍾,置冰上冷卻2分鍾,使DNA充分變性後,將變性探針直接加入袋中。應盡可能除淨袋中空氣,封住袋口。將封好的雜交袋再封入另一個未汙染的塑料袋,置42℃水浴保溫過夜。