二、Southern印跡
（一）原理
Southern印跡是指將電泳分離的DNA片段轉移到一定的固相支持物上的過程。DNA分子被限製酶酶切，經瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離，然後將含DNA片段的瓊脂糖凝膠變性，並將其中的單鏈DNA片段轉移到硝酸纖維素膜或其他固相支持物上，而各DNA片段的相對位置保持不變。這種濾膜即可用於下一步的雜交反應。利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限製性片段長度多態性分析（RFLP）等。
本實驗用限製酶EcoR Ⅰ 消化pUC 19-ApoA Ⅰ 質粒，通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得片段，隨後將DNA在原位進行堿變性，並從凝膠轉移至硝酸纖維素濾膜（Southern轉移）。DNA轉移至濾膜的過程中，各個DNA片段的相對位置保持不變。將固定在膜上的DNA與0.89kb的ApoA Ⅰ DNA探針（放射性核素或生物素標記）進行雜交，經放射自顯影（32p）或顯色（生物素）可確定與探針互補的電泳條帶的位置。所獲得的條帶可證實與ApoA Ⅰ DNA探針互補的DNA的存在。將條帶的位置與凝膠中DNA標準參照物的位置（電泳後已拍照）進行比較，可以確定DNA片段的大小。
（二）主要儀器、材料和試劑
1.主要的儀器和材料
熱封口器、-70℃低溫冰箱、水浴箱、電泳儀、電泳槽、攝影設備、手提式紫外燈、真空泵、真空幹燥箱、放射性核素廢物箱、搪瓷盤、鑷子、剪刀、塑料手套、解剖刀、玻璃板、硝酸纖維素濾膜（0.45μm）、塑料袋、塑料薄膜、X線底片、增感屏、曝光暗盒、新華2號濾紙、紙巾或吸水紙。
32P標記的ApoAⅠDNA探針、EcoRⅠ酶切的pUC 19-ApoAⅠ質粒DNA。
2.試劑
10mg／ml溴化乙錠、加樣緩衝液（DNA凝膠電泳用）、限製酶EcoRⅠ、10×限製酶緩衝液、1.51mol／L NaCl，0.51N NaOH、1.51mol／L NaCl，1mol／L Tris-Cl pH7.4、20×SSC溶液2×SSC溶液、6×SSC溶液、20％SDS、2×SSC，1％SDS、1×SSC，0.5％SDS、0.2×SSC，0.1％SDS、0.1×SSC，0.1％SDS、50×Denhardt's試劑、瓊脂糖、10mg／ml鮭精DNA、甲酰胺。
（三）操作步驟
1.凝膠中核酸的變性
（1）電泳結束後，在凝膠旁放置一透明尺，在紫外燈下拍照，然後將凝膠移至一個搪瓷盤內，在凝膠左上角（加樣孔一端為上）切去一角作為下列操作中凝膠方位的標記。
（2）用500ml 1.5mol/L NaCl，0.5N NaOH浸泡凝膠45分鍾，並且置於旋轉平台上地不斷溫和的振搖，使DNA變性。
（3）用去離子水漂洗凝膠片刻，隨後將凝膠浸泡於500ml 1mol／L Tris-Cl（pH7.4），1.5mol／L NaCl中，於室溫下不斷溫和的振搖使之中和。
2.Southern轉膜（毛細管虹吸法）
（1）當凝膠仍浸於中和液時，將一疊玻璃放入一個大搪瓷盤，做成一個長和寬均大於凝膠的平台。將一張新華濾紙放在平台上，倒入20×SSC溶液，使液麵略低於平台表麵，當平台上方的濾紙濕透後，用玻棒趕出所有的氣泡。
（2）裁一張硝酸纖維素膜，其長和寬均比凝膠大1mm（注意須戴手套才能接觸濾膜，因為凡被油膩的手接觸過的濾膜均不易被浸濕）。將濾膜浮在去離子水表麵，直至濾膜從下向上濕透，隨後用20×SSC浸泡濾膜至少5分鍾。剪去濾膜的一角，使其與凝膠的切角相對應。
（3）將凝膠翻轉，倒置在平台上（注意濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡）。用塑料薄膜圍繞凝膠周邊（注意不要覆蓋凝膠，防止液流短路，這種液流短路現象是導致凝膠中的DNA的轉移效率下降的主要原因）。
（4）將硝酸纖維素濾膜放在凝膠上，使兩者的切角相重疊（注意濾膜的一條邊緣應剛好超過凝膠上部加樣孔一線的邊緣。濾膜置於凝膠表麵後就不應移動，濾膜與凝膠之間不應留有氣泡）。
（5）將兩張與凝膠一樣大小的濾紙用2×SSC溶液浸濕，然後將濕潤的濾紙放在濕潤的硝酸纖維素濾膜上用玻璃棒趕出其間滯留的氣泡。切一疊（5～8cm高）略小於濾紙的紙巾或吸水紙，將其放在濾紙上，並在紙巾上放一塊玻璃板，然後用一個500克左右的重物壓實過夜，當紙巾浸濕後，應更換新紙巾。
（6）轉移結束後，揭去凝膠上的紙巾和濾紙，翻轉凝膠和硝酸纖維素濾膜，將凝膠在上置於一張幹的濾紙上，用一支極軟的鉛筆或圓珠筆在濾膜上標記凝膠加樣孔的位置。
（7）從硝酸纖維素濾膜上剝離凝膠棄之，以6×SSC溶液於室溫浸泡濾膜5分鍾，除去粘在濾膜上的瓊脂糖碎片。
（8）從6×SSC溶液中取出濾膜，將濾膜上的溶液滴盡後平放在一張紙巾上，於室溫晾幹30分鍾以上。將晾幹的濾膜放在兩張濾紙中間，用真空烤箱於80℃幹烤2小時，濾膜可用於雜交或保存在真空幹燥器中。
3.Southern雜交
（1）配製預雜交液（每平方厘米硝酸纖維素濾膜約需預雜交液0.2ml）：10ml甲酰胺、2ml 50×Denhardt's 、5ml 20×SSC、 100μl 20％SDS 、2.9ml ddH2O 、鮭精DNA。
（2）將預雜交液加入塑料袋之前，先預熱至42℃。將表麵帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入—個稍寬於濾膜的塑料袋，用5～10ml 2×SSC浸濕濾膜。將鮭精DNA置沸水浴中10分鍾，迅速置冰上冷卻1~2分鍾，使DNA變性。
（3）從塑料袋中除淨2×SSC，加入預雜交液，按每平方厘米濾膜加0.2ml加入變性的鮭精DNA（10mg／ml），至終濃度200μg／ml（注意袋中的空氣應盡可能除淨）。用熱封口器封住袋口，上下顛倒數次使其混勻置於42℃水浴中溫育4小時。將標記的DNA探針置沸水浴10分鍾，迅速置冰上冷卻1～2分鍾，使DNA變性。
（4）從水浴中取出含有濾膜和預雜交液的塑料袋，剪開一角，將變性的DNA探針加到預雜交液中（注意要盡可能除淨袋中的空氣，封住袋口，盡可能的減少滯留在袋中的氣泡），為避免放射性核素汙染水浴，將封好的雜交袋再封入另一個未汙染的塑料袋。置42℃水浴溫育過夜（至少18小時）。