第三節 核酸分子雜交技術
核酸分子雜交（nucleic acid hybridization）是指具有互補係列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。雜交的雙方分別稱為探針與待測核酸，雜交後形成的異源雙鏈分子稱為雜交分子。
核酸分子雜交的基本原理是：具有互補序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）堿基互補配對結合，重新形成雙鏈；在這一過程中，核酸分子經曆了變性和複性的變化，以及複性過程中各分子間鍵的形成和斷裂等。在雜交體係中已知的核酸係列稱為探針（probe），探針通常用於進行核素和非核素示蹤標記。
利用互補堿基的氫鍵特性可將標記的DNA或RNA片段作為探針，用於檢測與其互補的另一條DNA或RNA片段。這個雜交技術的過程是指通過互補堿基的氫鍵形成DNA或RNA的雜交，這個名詞目前已被更廣泛地應用在RNA或DNA互補鏈的結合中。雜交或互補序列的有效結合受鹽濃度、溫度和特殊化學成分如甲酰胺（形成氫鍵）等化學條件的影響。高溫低鹽條件使氫鍵解離、雜交分離或降解。雜交的最適溫度與參與聚合物的類型（RNA對DNA）有關，並且也依賴於嘧啶對嘌呤堿基的百分比，因為GC配對是三個氫鍵，較AT和AU配對的雙氫鍵要緊密。
任何DNA或RNA序列帶有某種標記物。最常用的標記物是放射性物質，通常用32P標記核苷酸。其他類型的標記物包括核苷酸熒光贅生物，或共價鍵生物分子如地高辛或生物素，它們可以被特異性的抗體所檢測。用這些標記的探針混合到一個DNA或RNA片段中並與其雜交就能用於證實互補核酸的存在。
有3種標記探針的基本方法即切口平移、隨機引物和末端標記。切口平移是用DNA酶Ⅰ處理雙鏈DNA，核酸酶可以解開相鄰兩個核苷酸的磷酸鍵產生DNA的單鏈切口，切口的3′端暴露的羥基作為DNA聚合酶的引物位點，沿著5′到3′的方向合成延伸DNA，同時沿著合成方向降解這條鏈的非標記部分。反應混合液中的放射性脫氧三磷酸核苷酸在反應時混合入新合成的DNA中就形成了標記探針。隨機引物的方法是雙鏈DNA首先解鏈，分解成單鏈DNA，隨之將隨機合成的短寡核苷酸引物和標記的脫氧三磷酸核苷酸及DNA聚合酶加入其中，結果沿著引物結合的兩條鏈在隨機位點上合成互補的DNA。DNA分子也可用末端標記的技術標記，即多聚核苷酸激酶將標記的磷酸加在DNA的5′端；另一個是末端轉移酶，它可將標記的單個核苷酸係列性地上百個加到探針DNA的末端。
雙鏈DNA探針的一個缺點是互補雙鏈彼此互相與靶序列競爭，單鏈探針就沒有這種缺點。單鏈探針也可以用克隆法生成，將靶DNA克隆入載體，RNA聚合酶依DNA模板在合成中將標記的核苷酸加入探針鏈而完成探針合成，以這種方式合成的一條RNA的探針被稱為RNA探針（riboprobe）。因為聚合酶有方向性的不同，所以根據使用酶的不同可以合成正義鏈或反義鏈探針。
事實上DNA或RNA探針與互補序列的雜交在證實靶DNA或RNA序列是否存在方麵已有大量的應用。其中一個應用就是驗證克隆文庫中的某個特異DNA序列是否存在。用與靶DNA序列互補的標記探針序列篩選噬菌體克隆斑或轉化質粒細菌克隆的方法被稱為斑點或菌落雜交。斑點和菌落可以用硝酸纖維素膜或尼龍濾膜放置在培養物的表麵而被轉移到上述兩種膜上，這個濾膜已按原培養器的排列做了記號。將DNA解鏈並固定在濾膜上，將濾膜孵育在放射性標記的互補靶序列探針的緩衝液中，使探針與噬菌體或質粒表達的靶DNA雜交。用一個具有增加打開氫鍵或降解弱交互作用傾向性（tendency）的洗液，洗去濾膜上非特異結合的成分及過量的探針，這個傾向性叫取向（stringency），是通過升高溫度，減少鹽或甲酰胺的濃度來實現的。高的取向性條件使緊密雜交的鏈不受破壞，如此就可篩選出與探針序列互補的準確匹配的序列。如果試圖從一個不同種屬間克隆一個同源基因，可能沒有完全一樣的序列。低取向性條件允許同源序列可以有一定程度的錯配序列雜交。洗膜、幹燥後放在X線膠片上，雜交克隆在膠片上呈現一個暗點，這些具有放射性探針雜交的區域可以與培養板原始區的部位相對應，就可定位陽性克隆。這些定位一致的斑點或菌落克隆可以被轉移、再培養和進一步地研究。
另一種用標記探針證實特異性DNA片段的方法是將瓊脂糖電泳分離的DNA帶用Southern印跡處理。經限製性酶消化的DNA片段和一個泳道的已知大小的標記標準DNA同時進行瓊脂糖電泳，雙鏈DNA片段經強堿處理後變為單鏈並在電泳中按大小被分開。將硝酸纖維素膜或尼龍濾膜放在膠上麵，在毛細作用下單鏈DNA就被轉移到膜上，膜上的位置與它們原始的膠上位置相對應。這個濃縮的DNA就在一個平麵固定在濾膜上，然後將膜與靶序列互補的探針雜交，像前麵描述的文庫篩選一樣進行篩選。經過適當地洗滌去除過量的探針，幹燥並用放射性自顯影分析，靶序列的區域在膠片上顯出暗帶。帶的密度與待測樣本中的有互補序列的DNA片段的數量成正比。片段的大小可以通過與標準分子量的斑點相比而確定。DNA印跡法常常用於測定臨床病原的基因以及遺傳病的診斷。
RNA印跡可用於驗明種屬特異的RNA的存在並可對其進行定量分析，通常用於mRNA。mRNA是從細胞或組織中分離出來的，可以經過或不經過poly（dT）柱的純化。根據靶序列轉錄的豐度來決定。對於稀有轉錄序列，為了能檢測到poly（A）+RNA，必須對其進行純化濃縮。與DNA印跡法一樣，mRNA也需要進行瓊脂糖電泳，但是由於mRNA的平均長度較短，所以一般不需要限製性消化。