染色步驟:
(1)固定於10%甲醛溶液或其他固定液的組織。
(2)石蠟切片或冷凍切片均可。
(3)染色前的一般手續,按照常規處理。
(4)經蒸餾水洗。
(5)將切片投入碳酸氨銀液內(45~50℃)1~2分鍾。
Del Rio Hortega法的碳酸氨銀溶液的配製:取10%硝酸銀水溶液5ml,加入5%碳酸鈉水溶液15ml,逐滴加入氨水,邊滴邊振蕩,直至沉澱被其溶解。再加55ml蒸餾水,過濾後即可應用。此溶液可較長時間貯存於褐色瓶中。
(6)還原顯影於1%甲醛溶液,直至切片呈現黃色。
(7)蒸餾水洗。
(8)以0.2%氯化金調色30秒鍾。
(9)蒸餾水洗。
(10)固定於5%硫代硫酸鈉1分鍾。
(11)自來水洗滌後,脫水、透明、封固。
結果:網狀纖維呈黑色。
(五)Foot法
染色步驟:
(1)固定於10%甲醛溶液或其他固定液的組織,以Zenker液固定者最佳。
(2)石蠟切片或冷凍切片均可。
(3)染色前常規處理。
(4)投入0.25%過錳酸鉀2~5分鍾。
(5)經蒸餾水洗後,投入5%草酸中2分鍾。
(6)用蒸餾水洗滌數次。
(7)浸入新鮮配製的碳酸氨銀溶液內,於56℃暖箱中15分鍾或更長一些,直至切片呈現棕黃色。
Foot法的碳酸氨銀溶液的配製:10%硝酸銀水溶液10ml,碳酸鋰飽和(1.25%)水溶液10ml。將以上兩液混合,立即產生沉澱,傾去其清液,用蒸餾水洗滌沉澱三次,而後以蒸餾水加至25ml,在沉澱中滴加強氨水約10滴左右,邊滴邊振蕩,使其溶解,再用蒸餾水或95%酒精加至100ml,過濾後應用。
(8)急速通過蒸餾水洗。
(9)在20%中性甲醛溶液中還原5分鍾。
(10)水洗片刻,投入0.2%氯化金中5分鍾。
(11)水洗後,固定於5%硫代硫酸鈉1分鍾。
(12)水洗,脫水,透明,封固。
結果:網狀纖維呈黑色
(六)Wilder法
染色步驟:
(1)固定於10%甲醛溶液或其他固定液的組織。
(2)石蠟切片,冷凍切片或火棉膠切片。
(3)染色前常規處理。
(4)經過蒸餾水洗後,投入0.25%過錳酸鉀1分鍾或10%磷鉬酸中1分鍾進行氧化。
(5)水洗後,投入10%溴氫酸1分鍾,如以磷鉬酸氧化,此步則不需要。
(6)蒸餾水洗。
(7)移入1%硝酸鈾中5秒鍾。
(8)於25℃浸入雙氨氫氧化銀溶液1分鍾。
Wilder法的雙氨氫氧化銀溶液的配製:配製方法與Gordon和Sweet法同。
(9)速洗於95%酒精。
(10)顯色於1%甲醛溶液+0.03%硝酸鈾溶液中1分鍾。
(11)洗於蒸餾水。
(12)以0.2%氯化金調色。
(13)蒸餾水洗。
(14)固定於5%硫代硫酸鈉1~2分鍾。
(15)水洗後,脫水,透明,封固。
結果:網狀纖維呈黑色。
以上內容即為幾種通用的網狀纖維氨銀顯示法。
基於網狀纖維在組織學技術中所顯示的嗜銀特異性,因而在製片操作時多需靠鍍銀技術,其中又以氨銀法最為通用。氨銀法是由以下各反應過程來完成的,為了在製片各環節中不致失誤,都能獲得滿意的效果,特簡介這些反應的特點和要求如下:
(1)固定與切片:組織的固定幾乎不受什麼限製。首選的固定劑是10%中性甲醛溶液或普通的10%甲醛溶液。其他如Helly液、Zenker液、Bouin液、Carnoy液及酒精等均可用。切片則以石蠟切片最通用,冷凍切片、恒冷箱切片及火棉膠切片也都可行。但由於在操作步驟中要經過強堿液處理,為防止切片脫落,也可考慮用1%火棉膠液敷膜保護,敷膜後經80%酒精硬化。
(2)所用的玻璃器皿都需經清潔液處理,保持化學純淨。操作過程中要避免直接與金屬器械接觸,所涉及的各試劑也應保持較高純度和新鮮。
(3)切片上的組織全部處理過程的反應特點,依次是:
1)氧化作用:目的是加強網狀纖維的染色效應,各種方法所用的氧化劑不同。如磷鉬酸、高錳酸鉀、過碘酸等等。
2)致敏作用:為使在進入銀液鍍銀之前能促使銀與組織形成銀的有機化合物,多在這一步以某種金屬鹽作為致敏劑,隨後該致敏金屬為銀化物中的銀所置換。致敏劑有鐵礬、硝酸鈾。甚或是硝酸銀的稀釋液等等。
3)氨銀液處理:配製氨銀液是將強堿性的濃氨液[NH4(OH)]逐滴的加於硝酸銀水溶液(約pH5),可見生成棕黑色的氫氧化銀(AgOH)沉澱。繼續慢慢滴加氨液,沉澱漸消失趨於透明而形成了二胺銀絡合物[Ag(NH3)2]。當然,在操作中應隨時搖勻溶液至該液達到略顯混濁為止。在加氨液時,如見銀液轉變為清澈透明,說明氨液已加過量,不妨再慢慢滴加銀液,使之恢複極輕度的混濁狀態,此時其酸堿度約pH11~12,已達到二胺銀絡合物濃度高而銀離子濃度低的水平,將該銀液過濾,濾過液即可使用。
4)還原作用:即所謂“顯影”。在二胺銀法中,多用甲醛作還原劑。在還原過程中,甲醛本身氧化成甲酸,而二胺銀絡合物在組織結構上還原成可見的金屬銀呈顯棕黑色。
5)調色:對還原後形成的金屬銀棕黑色沉澱,繼續用氯化金(AuCl3)處理,使之成為紫黑色金屬金,即“調色”。金屬金比金屬銀穩定,因顯示較好的對比度而清晰。
6)消除未反應銀:將切片浸入硫代硫酸鈉溶液。硫代硫酸離子可使切片上尚殘留的銀絡合物及未反應的離子銀成為可溶性,再用水洗除,同時也洗除多餘的氯化金。這一步驟在於防止未反應銀以後因受光照再發生非特異性還原而成為金屬銀。
7)相應的複染視需要而定,它隻是顯示其他組織成分。
第四節 肌組織常用染色
肌組織的染色,在常規組織檢查時,一般經石蠟切片、HE染色已能較清晰顯示;經伊紅延長染色時間後,95%酒精分色,很易與結締組織區別,肌纖維著色深,結締組織著色較淺。通常以磷鎢酸蘇木精染色(PTAH),顯示骨骼肌和心肌橫紋,尤具特異性。
一、Gomori三色染色一步法
染色步驟:
(1)組織固定不限,含汞者須先脫汞。
(2)入水漂洗。
(3)在Bouin液56℃,1小時,或室溫過夜。容器須加蓋。