正文 第五章 光鏡結締組織、肌組織實驗研究(二)(2 / 3)

醛酸對染色體的保存如在生活時一樣,因此所有固定染色體的固定液中幾乎都有醋酸。它又隻能把未分裂細胞核的染色質沉澱成為可以染色的塊狀體,因此細胞核被顯示得很清楚。

醋酸的缺點是能使組織膨脹,特別是對於膠原纖維及原漿中的纖維蛋白更顯著,故單獨使用時,隻能固定極短的時間,其一般都與其他藥劑配合使用。高濃度的醋酸會破壞線粒體和高爾基體,所以在線粒體和高爾基體製片的固定液中都不用醋酸。

(4)苦味酸:苦味酸是一種黃色結晶,是一種相當強的酸。它在空氣中能自燃,在密閉器中能劇烈爆炸,為使用安全起見,常製成飽和水溶液貯藏保存。苦味酸易溶於酒精、二甲苯、苯、水。它可沉澱一切蛋白質,使其成為苦味酸和蛋白質的化合物而不溶於水。但其對脂肪及類脂體無作用。

苦味酸的穿透速度慢,其使組織收縮顯著,但並不使組織硬化,一般不單獨使用,苦味酸固定時間不宜過久,否則會影響蘇木精等堿性染料的染色。

苦味酸固定組織所產生的黃色,在以70%酒精脫水時加入少許碳酸鋰飽和水溶液即可除去,因苦味酸與碳酸鋰作用生成的鹽類易溶於水中。黃色在平常脫水時也可脫去,即使遺留少許在組織中,所存微量酸性也不足以影響染色。

(5)重鉻酸鉀:為橙紅色結晶,有毒,重鉻酸鉀為強氧化劑,不能與還原劑如酒精等混合。重鉻酸鉀本身不能沉澱蛋白質,但可使蛋白質次價變高,變為不溶性,使其保持與生活狀態相仿,故對細胞質固定很好。重鉻酸鉀還能固定類脂體,使其不溶於脂溶劑,所以可固定高爾基體、線粒體、脂肪。但能溶解染色質,不能固定染色體,對核的染色不良。

重鉻酸鉀的穿透速度快,組織收縮很小,有時還使組織稍膨脹,經酒精脫水後則使組織繼續顯著收縮。經重鉻酸鉀固定的組織對酸性染料染色很好,但對堿性染料染色較差。因染色質被溶解之故,故加入核的固定劑可補足其不足。

重鉻酸鉀固定的組織須用流水衝洗12~24小時,也可用亞硫酸代替流水。

重鉻酸鉀配入混合固定液中,加Zenker液、Helly液、Maximov液、Rcgaud液,可成為細胞學製片的良好固定劑。但必須注意與甲醛混合時需在用前配製,不能久存。

(6)鉻酸:為強氧化劑,故不可與酒精及甲醛溶液等還原劑混合。鉻酸是弱酸,呈紅色或深褐色的結晶,其溶液為淡褐黃色。它能沉澱一切蛋白質,所產生的沉澱不溶於水,與蛋白質的作用可能是化學的結合。

鉻酸能固定高爾基體及線粒體,隻有鉻酸才能真正固定肝糖使之不溶於水。

鉻酸穿透速度較慢,一般大小的組織須固定12~24小時,硬化組織的程度中等,組織收縮少。一般使用濃度為0.5%~1%。固定組織時宜貯於暗處以免蛋白質溶解。鉻酸是強烈的沉澱劑,故不能單獨使用,常與鋨酸配成混合液以補鋨酸之不足。鉻酸不妨礙鋨酸保存線粒體及內網器,對細胞質及胞核固定十分均勻。

(7)氯化汞:通稱升汞,是一種極毒的藥品,呈白色粉末狀,以針狀結晶為最純。

氯化汞能沉澱一切蛋白質(包括核蛋白),使蛋白質變性而不溶於水,但溶於氯化鈉或碘化鉀飽和溶液,如在升汞飽和液中加入5%醋酸,蛋白質沉澱則不溶於氯化鈉或碘化鉀飽和液。升汞對類脂和糖類沒有固定作用,但也不起破壞作用。

升汞的穿透力較弱,通常用於小型的材料,很少單獨使用,但因其對蛋白質的凝固作用極強,因而能充分地固定細胞質和細胞核,並可增加對酸性染料的親和力,如使番紅、卡紅將組織染得很好,其他染料和蘇木精也可染得好。

升汞能使組織收縮,故多與冰醋酸、鉻酸鹽及甲醛混合使用,固定後經酒精脫水組織還有收縮。組織硬化程度僅次於酒精及甲醛溶液。

用含升汞固定的組織,會有針狀和無定形的結晶產生,前者一般認為是氯化亞汞(甘汞)的沉澱,後者可能是金屬汞,這些沉澱物的發生可能是升汞與組織內磷化物作用的結果。沉澱物可在脫水過程中用碘酒洗去。

(8)四氧化鋨:通稱鋨酸,呈淡黃色結晶。為強氧化劑,不可與酒精及甲醛混合,其水溶液極易還原,隻要遇一點有機物即還原成氫氧化鋨生成黑色沉澱,此時不可再用。光能促成其還原作用,故必須貯於有色瓶內保存。為預防其還原,可於100ml水溶液中加入5%氯化汞10滴。

四氧化鋨溶液不沉澱蛋白質,而使蛋白質凝膠化,故用鋨酸所固定的細胞能保持生活時的均勻性。其不使細胞收縮,因此對胞質固定很好,但對核的固定不好,其原因是四氧化鋨可使核蛋白發生過於強烈的沉澱。

四氧化鋨為脂肪及類脂體的惟一固定劑,特別用於線粒體及高爾基體的固定。它不溶於酒精及苯,但可稍溶於二甲苯,極易溶於鬆節油中,故製片時以苯代替二甲苯可獲得良好效果。

四氧化鋨的穿透速度很慢,可保持組織的柔軟。固定後的標本須經流水衝洗12~24小時,使其完全被洗淨,否則四氧化鋨遇酒精即發生沉澱。

四氧化鋨固定的組織染色很困難,它的毒性高,其蒸氣有一種微弱的令人愉快的氣味,易損傷眼睛及黏膜,故使用時應注意勿使瓶口對著臉麵。因其極易揮發,器皿必須密封。固定常用1%~2%濃度的水溶液。

2.常用混合固定液的配製

上述簡單固定劑隻能固定細胞的某一種成分,如要同時固定細胞內的多種成分,必須用多種藥品配合成混合固定液,利用它各自的優缺點相互平衡而配成。例如醋酸使組織膨脹,酒精使組織收縮,二者配合在一起效果較好。又如四氧化鋨的殺死力極高,滲透力極低,則可用醋酸來補足它的缺點。

甲醛為還原劑,能使重鉻酸鉀發生沉澱,故在臨用時加入,24小時失效。用時取貯存液95ml加入5ml甲醛。

(1)甲醛溶液(Formaldehyde solution):又稱甲醛溶液(Formalin),是一種無色透明;有刺激性臭味;具有腐蝕性的溶液。純甲醛為氣體,甲醛溶液中含有36%~38%甲醛,通常加入10%~12%的甲醇做穩定劑,以防甲醛聚合。甲醛溶液在空氣中或受日光作用,可逐漸氧化成甲酸。配製固定液的濃度采用4%~8%,也就是一般習慣上稱的10%或20%甲醛溶液。此液滲透力較強,使組織收縮較少,普遍用於組織的固定。

經甲醛溶液固定的組織,可直接入脫水劑脫水,但固定時間長的組織因含有甲酸,則需經24~48小時流水衝洗,否則會影響染色效果。不同濃度的甲醛溶液配製如下: