第二節 光鏡組織切片技術
應用一般光學顯微鏡（簡稱光鏡）觀察骨組織切片是骨傷學研究的最基本方法。取動物或人體的新鮮骨及軟組織組織塊，先以固定劑固定，使組織中的蛋白質迅速凝固，防止細胞自溶和組織腐敗。固定後的組織塊（約3~5mm3大小），用石蠟、火棉膠或樹脂等包埋成硬塊，以切片機切成5~10μm厚的組織切片，切片貼在載玻片上經脫蠟等步驟後進行染色。以封固劑和蓋片封固，即可長期保存，又可方便鏡下觀察。
一、石蠟切片的基本程序
（一）取材
取材在製作切片中是非常重要的一個環節，必須注意材料的新鮮，否則會直接影響組織切片的質量和實驗的成功率。一般皆在動物麻醉下取材。在取材前要盡量避免動物過度疲勞，迅速將動物殺死。在實驗室中采用的麻醉法一般常用乙醚、氯仿或戊巴比妥鈉（30mg／kg）。動物麻醉後即可根據實驗的目的要求進行取材，所取的部位加以固定。軟組織如肌肉、肌腱等取材，必須使用銳利的剪刀和刀片一次割取，切勿擠壓和揉攪，宜避免損壞組織。如組織塊較大，可先放入固定液中數小時，再取材。所取組織的大小要保證研究組織的完整，要包括正常結構和病變部分以利於對比觀察。一般情況下，取材的組織塊以1cm×1cm×0.3cm以內為宜；如觀察範圍大，可達到1.5cm×1.5cm×0.5cm，但最厚不能超過0.5cm。否則不利於固定、脫水、浸蠟等步驟，影響切片效果。
（二）固定
從動物體取出的各種組織在製作切片前須固定。因為動物死後血液循環停止，細胞逐漸死亡，若不立即固定，則細胞出現 。自溶現象是由於細胞自身的酶和微生物的繁殖所致，其使組織結構遭到破壞，失去原來的結構。固定劑的浸漬，不僅可以防止組織自溶及腐敗，並能沉澱或凝固組織內的蛋白質、脂肪、糖、酶等各種成分，使細胞結構仍保持與生活狀態時相仿。固定液也有硬化作用，可增加組織的硬度，使組織不易變形。
預固定的組織必須新鮮，一般在動物死後立即取材為宜，即組織越新鮮越好。固定的時間長短因組織塊的大小及固定液的性質而不同。某些固定液對組織的硬化作用較強，則固定的時間不宜過長，以免組織過硬，影響切片質量。而某些固定液可以作永久保持的固定機劑，其對組織無大影響。
為了達到組織固定良好效果，必須注意以下幾個方麵：①組織塊不宜太大，一般為0.5cm2即可；②固定劑的用量：固定組織時應有足夠的固定劑，一般為組織塊體積的10~15倍。容器勿過小，材料勿太多，避免組織內水分在固定時滲出，影響固定劑的濃度；勿使組織貼於瓶底或瓶壁，以免影響固定劑的滲入；在固定較精細的材料或用純酒精為固定劑的標瓶底要墊以棉花，使固定劑能均勻的滲入；對弱的和作用較慢的固定劑如苦味酸，固定劑的量要多（約100倍材料體積的量）；而強的固定劑如F1ernming液則量可少些。固定液用量應為組織塊的30倍。③固定的時間，視材料的種類、性質、大小、固定劑種類、性質、滲透力的強弱而定，可從1~2小時到十幾小時或二十幾小時，也有長至幾天的。一些小的材料僅須幾十分鍾。某些固定劑（如Carnoy）對組織的硬化作用較強，固定時間不宜過長，但有些固定劑（如Bouin）固定時間較長也無關係。一般固定24小時左右即可。此外，固定時間的長短與溫度有密切關係，固定一般在室溫中進行。增加溫度雖可縮短固定時間，但組織變化較大，尤其是組織化學染色更不相宜。
1.下麵介紹幾種常用固定劑的性能及其使用
（1）甲醛：甲醛為一種氣體，溶於水成為甲醛水溶液或稱甲醛溶液，一般市售為37％～40％的甲醛水溶液，易揮發，有強烈的刺激性氣味。由於甲醛為一種強還原劑，所以不可和鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸等氧化劑混合，因其極易被氧化為甲酸。
甲醛溶液固定組織，它的滲透力強，組織收縮少，但經酒精脫水時收縮很大，它能使組織硬化並增高組織的彈性。其可較為均勻的固定厚度適當的組織。因甲醛為非沉澱性固定劑，它不能使清蛋白及核蛋白沉澱，但可與蛋白質化合，為一般病理製片所常用，因既可固定組織，也可用於保存組織（大體標本）。
組織固定和標本的保存，常用10％甲醛液，其配法是取市售37％～40％甲醛溶液10ml與90ml蒸餾水混合即可。用10％甲醛液固定小塊組織（1.5cm×1.5cm×0.2cm）數小時即可，時間稍長也無關係。對於較長時期固定的標本，須流水衝洗24小時，甚至48小時，否則會影響染色。甲醛溶液放置日久，能產生白色沉澱即三聚甲醛，但其在高溫下又可變回甲醛。甲醛容易氧化，變成甲酸能使標本增加酸性，嚴重時影響胞核的染色，因此在備用的甲醛溶液中宜放入小量的碳酸鎂或碳酸鈉或大理石作為中和劑。簡單的方法為在500ml原液中加入約2cm厚的碳酸鎂將原液中和至pH7.6，中和後的甲醛久存易恢複酸性，但也會失去中和作用。
（2）乙醇（酒精）：為無色液體，可與水在任何比例下相混合。它是一種還原劑，很易被氧化為乙醛，再變為醋酸，所以不能與鉻酸、重鉻酸鉀、鋨酸等氧化劑混合。酒精可沉澱清蛋白、球蛋白、核蛋白，前二者所生之沉澱不溶於水，後者所生之沉澱則溶於水，所以經酒精固定的標本核的染色不良。酒精並不與蛋白質結合生成化合物，但卻從其內提取水分，故多作為脫水劑。
酒精的穿透速度很快，在與其他固定液混合使用時可以增加它們的穿透力，一般固定用95％或100％酒精。酒精固定的組織硬化顯著，組織在高濃度酒精中留置過久會發脆，也會收縮得厲害，約可縮小原體積的20％。僅70％酒精可較久的保存組織。
酒精濃度在50％以上，可溶解脂肪及類脂體，又因其能溶解血紅蛋白及損害多數其他色素，所以要證明細胞內的脂肪、類脂體及色素的存在不能用酒精作為固定劑。
酒精雖可沉澱肝糖，但其沉澱物仍可溶解於水，故肝糖的製片標本不能投入濃度低於50％的酒精中。
（3）醋酸（乙酸）：純醋酸為帶有刺激味的無色液體，在嚴寒時常結成冰狀，故稱純醋酸為冰醋酸。固體醋酸約在17℃時熔化，它可以以各種比例與水及酒精相混合。
固定組織常用5％的醋酸溶液，它不能沉澱清蛋白、球蛋白，但能沉澱核蛋白，所以組織的染色質可固定得很好。醛酸的穿透速度很快，一般大小的組織隻須固定1小時，因其不能沉澱細胞質的蛋白質，所以組織不會硬化，且其可防止組織塊經酒精時所引起的高度收縮及硬化。