目的要求
掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析方法和測定果蔬組織中蛋白質相對分子質量的基本原理和實驗技術。
基本原理
由於植物來源和發育程度不同，果蔬組織的蛋白質種類、含量與組成成分等各方麵差異非常大，常常需要利用電泳技術研究果蔬蛋白質的變化。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）是一種能夠分離和測定蛋白質組成的電泳方法，主要用於測定蛋白質亞基分子質量。
帶電粒子在電場中向帶有相反電荷的電極移動，稱做電泳。若以v代表球形分子在電場中的移動速度，E代表電場強度，q為帶電粒子所帶電荷量，粒子半徑為r，溶液黏度為η，則v=Eq/6πrη，即電泳速度與電場強度和顆粒所帶電荷量成正比，而與顆粒的大小、溶液的黏度成反比。在一定的pH條件下，每一種分子都具有一定的電荷、大小與形狀，在相同的電場經一定時間的電泳，便會集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。不同組分的蛋白質（包括同功酶）分子組成、結構、大小、形狀均有所不同，在溶液中所帶的電荷不同，在電場中的運動速度也不同。
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作支持介質的一種電泳方法。它是由丙烯酰胺單體（acrylamide，ACr）和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺（N,N′-methylena bisacrylamide，BIs）在引發劑（過硫酸銨，AP）和催化劑（N,N,N′,N′-四甲基乙二胺Tetramethylenedismine，TEMED）的作用下，聚合交聯而成的三維網狀結構凝膠，其網孔大小可由凝膠濃度和交聯度加以調節。氧能抑製聚合反應，可根據實驗情況決定是否在聚合前對凝膠混合物進行脫氣。ACr和BIs的濃度、交聯度可以決定凝膠的密度、黏度、彈性、機械強度以及孔徑大小。100mL凝膠溶液中含有的單體和交聯劑總質量為凝膠濃度，用T表示。凝膠溶液中凝膠劑占單體加交聯劑總質量的質量分數稱為交聯度，用C表示。
當ma/mb＜10時，形成的凝膠脆、硬，呈乳白色；ma/mb＞100時，即使5%的凝膠也呈糊狀，易斷裂。要製備透明而有彈性的凝膠，ma/mb要控製在30左右。通常T在2％～5%時，ma/mb＝20左右；T在5%～10%時，ma/mb＝40左右；T在15%～20%時，ma/mb=125～200左右。T在3%～25%的範圍內，凝膠易發生聚合。根據材料及目的蛋白質的不同選擇凝膠濃度。
凝膠電泳兼有電荷效應和分子篩效應。被分離物質由於所載電荷數量、分子大小和形狀的差異，因此在電泳時產生不同的泳動速率而相互分離。
在聚丙烯酰胺凝膠係統中，加入一定量的陰離子去汙劑——十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），能打開蛋白質分子的氫鍵和疏水鍵，並按比例地結合到這些蛋白質分子上形成帶負電荷的蛋白質-SDS膠束（protein-SDS micelles），使蛋白質分子表麵完全被負電荷所覆蓋，且所帶電量遠遠大於蛋白質分子原有的電荷量，掩蓋了蛋白質間原有的電荷差異；同時在水溶液中，蛋白質-SDS膠束成橢圓棒短軸形，其長度與亞基相對分子質量的大小成正比，因此在SDS電泳體係中，電泳遷移率僅取決於蛋白質的相對分子質量大小而與其所帶電荷性質無關。在條件一定時，將已知相對分子質量的標準蛋白質的遷移率對相對分子質量的對數作圖，可獲得一條標準曲線。未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得相對分子質量。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按照凝膠電泳係統中的緩衝液、pH和凝膠孔徑的差異可分為SDS-連續係統電泳和SDS-不連續係統電泳兩類；按照所製成的凝膠形狀和電泳方式又可以分為SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直管型電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳兩類。本實驗采用SDS-不連續垂直板型操作方法。
材料、儀器及試劑
（一）材料
蘋果、梨、番茄等果實；菠菜、香菜等蔬菜。將材料洗浄去除表麵土粒和灰塵待用。
（二）儀器及用具
電泳儀1套（穩壓電源、垂直電泳槽和相配套的凹槽玻璃）、台式高速離心機、水浴鍋、離心管、移液器（5mL、1000μL、100μL、50μL）、燒杯若幹（100mL、50mL）、容量瓶（1000mL、100mL）、研缽、玻璃棒、濾紙、20mL培養皿2個（或用白瓷盤代替，染色用）、海綿塊、搖床、鑷子。