目的要求
了解植物體內β-1,3-葡聚糖酶的作用，學習果蔬組織中β-1,3-葡聚糖酶活性的測定原理和方法。
基本原理
葡聚糖是葡萄糖殘基以β-1,3-糖苷鍵連接起來的多聚糖化合物，是絕大多數真菌細胞壁的主要成分。植物中的葡聚糖酶能以隨機作用方式將多聚糖水解成為糊精或寡聚糖，使真菌細胞壁受到損壞，從而抑製真菌的生長繁殖和對植物的侵染能力，特別是在與幾丁質酶的協同作用下，可明顯抑製真菌的生長。在正常情況下，高等植物體中葡聚糖酶表達水平很低，而當植物體被真菌、細菌、病毒侵染或受到機械損傷時，其含量和活性可提高幾十倍至上百倍，以增強植物體對不良外界刺激產生抗性反應。
高等植物體內廣泛存在著β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）。β-1,3-葡聚糖酶能夠作用於葡聚糖的β-1,3-糖苷鍵，產生還原性末端。因此，利用3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑測定生成還原糖的量，可以用來表示β-1,3-葡聚糖酶活性。
材料、儀器及試劑
（一）材料
梨、番茄、芒果、香蕉等。
（二）儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、分光光度計、計時器、移液器、離心管、水浴鍋、具塞刻度試管（25mL）、容量瓶（100mL、1000mL）。
（三）試劑
1.0.1mol/L、pH 5.2乙酸-乙酸鈉緩衝液
母液A和母液B配製方法見附錄1。
取105mL母液A和395mL母液B混合後，調節pH至5.2，稀釋至1000mL，即為0.1mol/L、pH 5.2乙酸-乙酸鈉緩衝液。
2.提取緩衝液
稱取29mg EDTA、0.1g L-抗壞血酸，吸取35μL β-巰基乙醇，加入到0.1mol/L、pH 5.2乙酸-乙酸鈉緩衝液中，定容至100mL，搖溶，即得提取緩衝液［含1mmol/L EDTA、5mmol/L β-巰基乙醇和1g/L L-抗壞血酸］，低溫（4℃）貯藏備用。
3.4g/L昆布多糖溶液
稱取100mg昆布多糖（Sigma）加入到25mL 0.1mol/L、pH 5.2醋酸緩衝液中，溶解後低溫（4℃）貯藏備用。
4.3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑
配製方法見實驗14方法1。
5.1mg/mL葡萄糖標準液
配製方法見實驗14方法1。
實驗步驟
（一）標準曲線的製作
取7支具塞刻度試管（25mL），編號，按所示的量，精確加入濃度為1g/L的葡萄糖標準液和3,5-二硝基水楊酸試劑。
將各管搖勻，在沸水浴中加熱5min，取出後立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再用蒸餾水稀釋至25mL刻度處，混勻。在540nm波長下，用0號管作為參比調零，測定顯色液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標，葡萄糖質量為橫坐標，繪製標準曲線，求得線性回歸方程。
（二）酶液提取、製備
稱取10.0g果蔬組織樣品，置於研缽中，加入10mL經預冷的提取緩衝液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉入到離心管中，於4℃、12000×g離心30min，收集上清液，低溫保存備用。
按照幾丁質酶測定方法（實驗27）中酶液製備方法，進行酶液的脫鹽處理。
（三）活性測定
取2支試管，分別加入100μL 4g/L的昆布多糖溶液。然後，向一支管中加入100μL酶液，向另一支管中加入100μL經煮沸5min的酶液作為對照，混勻。將反應管置於37℃保溫40min。保溫後向反應管中加入1.8mL蒸餾水和1.5mL DNS試劑，在沸水浴中加熱3min。再用蒸餾水將顯色的反應液稀釋至25mL，混勻。測定混合液在540nm處吸光度值。重複三次。
實驗結果與計算
1.測定數據記錄
2.計算結果
根據樣品管反應液和對照管反應液的吸光度值的差值，在標準曲線上查出相應的葡萄糖質量（mg），以每秒鍾每克樣品（鮮重）中酶分解昆布多糖產生1×10-9mol葡萄糖為一個β-1,3-葡聚糖酶活性單位，單位是1×10-9mol/s·g mF。
思考題
試討論提取液中β-1,3-葡聚糖酶水解昆布多糖的過程受哪些條件的影響？