目的要求
了解植物體內幾丁質酶的作用，學習果蔬組織中幾丁質酶活性的測定原理和方法。
基本原理
植物在受病原物侵染時，常產生一些病程相關蛋白（pathogensis-related proteins，PR蛋白）以抵禦病原菌的進一步侵染。幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶便是兩類重要的PR蛋白。高等植物體內廣泛存在幾丁質酶，能降解多種真菌細胞壁的主要成分——幾丁質，從而對病原菌生長具有直接的抑製作用。辣椒、芒果、梨、柑橘等果蔬的采後抗病性與這兩種酶的活性密切相關。許多生物因子和非生物因子、如采後熱處理、抗病誘導製劑處理等都能誘導果蔬幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性升高，從而提高果蔬采後抗病性，抑製病害的發生。
幾丁質酶主要水解幾丁質多聚體中的β-1，4-糖苷鍵，依據水解位置的不同可分為內切幾丁質酶和外切幾丁質酶。幾丁質酶催化幾丁質水解形成的產物為N-乙酰葡萄糖胺（Glc-NAc）單體。通過利用二甲氨基苯甲醛測定幾丁質酶催化的水解過程中產生的Glc-NAc的生成量可以反映幾丁質酶的活性。
材料、儀器及試劑
（一）材料
梨、番茄、芒果、香蕉等。
（二）儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、分光光度計、計時器、移液器、離心管、水浴鍋、具塞刻度試管（25mL）、容量瓶（100mL、1000mL）。
（三）試劑
1.0.1mol/L、pH 5.2乙酸-乙酸鈉緩衝液
配製方法見附錄1。
2.提取緩衝液
稱取29mg EDTA，吸取35μL β-巰基乙醇，加入到0.1mol/L、pH 5.2乙酸-乙酸鈉緩衝液中，定容至100mL，搖溶，即得提取緩衝液（含1mmol/L EDTA和5mmol/L β-巰基乙醇），低溫（4℃）貯藏備用。
3.50mmol/L、pH 5.2乙酸-乙酸鈉緩衝液
4.10g/L膠狀幾丁質懸浮液
稱取1.0g幾丁質（Sigma產品），加入4mL經4℃預冷的丙酮在冰浴、通風條件下充分研磨，期間可適量加入丙酮，應充分研細。然後邊研磨邊緩緩加入30mL濃鹽酸，幾分鍾後完全溶解，於4℃、8000×g離心15min，收集上清液。將上清液緩緩加入到劇烈攪拌的50%乙醇溶液中（至少是上清液的5倍體積以上），充分攪拌後靜置使膠狀幾丁質沉澱析出。通過過濾棄去上清液，收集膠狀幾丁質沉澱。用去離子水反複衝洗收集到的膠狀幾丁質沉澱至pH 7.0後，定容至100mL，即製備成10g/L的膠狀幾丁質懸浮液，避光保存於冰箱中。
5.30g/L脫鹽蝸牛酶溶液
稱取0.6g脫鹽蝸牛酶，溶解到20mL 0.1mol/L、pH 5.2乙酸-乙酸鈉緩衝液中，低溫避光保存。
6.0.6mol/L四硼酸鉀溶液
稱取9.71g K2B4O7·5H2O，用蒸餾水溶解，定容至50mL。
7.對二甲氨基苯甲醛（DMAB）儲備液
稱取10.0g DMAB溶於87.5mL冰醋酸和12.5mL 10mol/L鹽酸混合液中，於4°C保存，使用前用冰醋酸稀釋5倍。
8.0.1mol/L N-乙酰葡萄糖胺標準液
稱取2.2mg N-乙酰葡萄糖胺，用少量乙醇溶解後，用蒸餾水再稀釋，定容至100mL。
實驗步驟
（一）標準曲線的製作
取6支具塞試管，編號，加入各成分。
加入0.2mL 0.6mol/L的四硼酸鉀溶液，將試管置於沸水浴中煮沸5min，然後迅速冷卻。冷卻後，加入2mL用冰醋酸稀釋5倍的對二甲氨基苯甲醛（DMAB）溶液，再在37℃保溫培養20min進行顯色反應。以0號試管為參比空白，於波長585nm處測定顯色液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標，N-乙酰葡萄糖胺物質的量(μmol)為橫坐標，製作標準曲線，求得線性回歸方程。