目的要求
了解測定遊離脯氨酸含量的意義，學習果蔬組織中遊離脯氨酸含量的測定原理和方法。
基本原理
果蔬組織在受到高溫或低溫脅迫時，組織中遊離脯氨酸含量會明顯升高。在逆境脅迫下，果蔬的抗逆性與組織遊離脯氨酸的積累程度有關。遊離脯氨酸親水性極強，可以防止細胞水分散失，還能穩定原生質膠體及組織內的代謝過程，降低冰點，從而增強低溫脅迫下果蔬組織的抗寒性。因此，遊離脯氨酸含量可作為一個重要的生理指標，在一定程度上反映了果蔬組織對不良環境脅迫的抵抗能力。
利用磺基水楊酸提取果蔬組織中的遊離脯氨酸，在酸性條件下經加熱處理後，能與茚三酮反應生成穩定的紅色縮合物。用甲苯萃取色素，色素的深淺程度與脯氨酸含量的高低有關。該紅色縮合物在波長520nm處有最大吸收峰，且在一定範圍內吸光度值的大小與脯氨酸濃度的高低成正比。因此，通過比色的方法可測定果蔬組織中遊離脯氨酸的含量。
材料、儀器及試劑
（一）材料
受冷害的和正常的香蕉、芒果、番茄果實。
（二）儀器及用具
分光光度計、研缽、燒杯、容量瓶（100mL、250mL）、具塞刻度試管（25mL）、移液器、水浴鍋、離心機。
（三）試劑
1.酸性茚三酮溶液
將1.25g茚三酮溶於30mL冰醋酸和20mL 6mol/L磷酸的混合溶液中，攪拌、加熱（70℃）溶解，待冷卻後貯於冰箱中。此液在4℃下2～3d有效。
2.30g/L磺基水楊酸
稱取3g磺基水楊酸，加100mL蒸餾水溶解。
3.乙酸（冰醋酸）
4.甲苯
5.脯氨酸標準溶液
準確稱取25mg脯氨酸，用蒸餾水溶解後定容至250mL，其濃度為100μg/mL。再取10mL該溶液，用蒸餾水稀釋至100mL，即為10μg/mL的脯氨酸標準液。
實驗步驟
（一）標準曲線的製作
取7支具塞刻度試管，編號，加入各試劑。混勻後加幾粒玻璃球，在沸水中加熱30min。取出試管，冷卻後向各試管中準確加入4mL甲苯，充分振蕩（30s）以萃取紅色物質。然後靜置，使色素全部轉至甲苯溶液。
待溶液分層後，用移液器輕輕吸取上層脯氨酸-甲苯溶液至比色杯中，以0號管為空白對照，於波長520nm處進行比色測定。以吸光度值為縱坐標，脯氨酸質量（μg）為橫坐標，繪製標準曲線，求得線性回歸方程式。
（二）提取
稱取2.0g果蔬組織樣品，置於研缽中，加入2.0mL 30g/L磺基水楊酸溶液，研磨勻漿後，轉入到試管中，再用3.0mL 30g/L磺基水楊酸溶液衝洗研缽，一並轉入試管中。將試管置於沸水浴中煮沸提取10min（提取過程中要經常搖動）。取出冷卻後於10000×g離心15min，收集上清液即為脯氨酸提取液。
（三）測定
吸取2.0mL提取液於具塞刻度試管（25mL）中，加入2.0mL冰醋酸及3.0mL酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。取出試管，冷卻後加入4.0mL甲苯，搖蕩30s，靜置。待溶液分層後，用移液器輕輕吸取上層脯氨酸-甲苯溶液至比色杯中，按照與製作標準曲線相同的方法進行比色測定。重複三次。
實驗結果與計算
根據顯色液的吸光度值，從標準曲線上查出顯色液中相應的脯氨酸的質量，計算果蔬組織樣品中脯氨酸含量，以μg/g表示。
思考題
(1)測定果蔬組織中遊離脯氨酸的含量有何意義？
(2)當改變萃取劑時，比色應做哪些改變？如何選擇最適波長？如何選擇最佳萃取劑？