（二）酶液提取
稱取10.0g果蔬組織樣品，置於研缽中，加入10.0mL經預冷的提取緩衝液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉入到離心管中，於4℃、12000×g離心30min，收集上清液，低溫保存備用。
（三）酶液製備
方法一：將上清液盛到透析袋中，置於蒸餾水中，於4℃透析過夜。然後於4℃、10000×g離心15min，收集上清液備用。如果上清液中蛋白質濃度過低，可以通過冷凍幹燥進行濃縮。
方法二：將上清液與5倍體積的經預冷的丙酮(分析純)混合，置於-20°C保持4h以沉澱蛋白質。然後於4℃、12000×g離心20min，收集沉澱，再用冷的丙酮洗滌沉澱兩次，最後用氮氣吹幹沉澱物。將沉澱物再溶解到50mmol/L、pH 5.2乙酸-乙酸鈉緩衝液中，同樣條件下離心，收集上清液，低溫保存備用。
（四）活性測定
1.幾丁質酶總活性的測定
取2支試管，分別加入0.5mL 50mmol/L、pH 5.2乙酸-乙酸鈉緩衝液，0.5mL 10g/L膠狀幾丁質懸浮液。然後，一支反應管中加入0.5mL酶提取液，另一支反應管中加入0.5mL經煮沸5min的酶液作為對照，混勻。將反應管置於37℃水浴中保溫1h後，加入0.1mL 30g/L的脫鹽蝸牛酶，混合，繼續在37℃保溫培養1h，以釋放生成N-乙酰葡萄糖胺（Glc—NAc）單體。保溫後取出，立即加入0.2mL 0.6mol/L的四硼酸鉀溶液，並在沸水浴中煮沸3min，然後迅速冷卻。冷卻後，按照與製作標準曲線相同的方法進行操作。重複三次。
2.外切幾丁質酶活性的測定
按照上述方法進行。反應混合液在37℃水浴鍋保溫1h後，直接加入0.2mL 0.6mol/L的四硼酸鉀溶液，並在沸水浴中煮沸3min，然後按照與製作標準曲線相同的方法進行操作。重複三次。
3.內切幾丁質酶活性測定
內切幾丁質酶活性=幾丁質酶總活性-外切幾丁質酶活性
實驗結果與計算
1.測定數據記錄
2.計算結果
根據樣品管反應液與對照管反應液吸光度值的差值，在標準曲線上查出相應的N-乙酰葡萄糖胺（Glc—NAc）物質的量(μmol)，以每秒鍾每克樣品（鮮重）中酶分解膠狀幾丁質產生1×10-9mol N-乙酰葡萄糖胺為一個幾丁質酶活性單位，單位是1×10-9mol/s·g mF。
注意事項
（1）也可利用丙酮沉澱、透析法或凝膠過濾法對樣品提取液進行脫鹽處理。也可以直接測定粗提液中幾丁質酶的活性。實驗需要多次摸索，優化選擇適宜的測定條件。
（2）顯色反應後，溶液呈現淡紫到紫紅色。溶液紫色的深淺程度在一定範圍內，與溶液中生成的N-乙酰葡萄糖胺量成正相關關係。
（3）實驗材料經過病原菌侵染或其它脅迫後，更易於測定酶活性。
（4）在酶活性單位定義中，1×10-9mol/s表示轉化常數（cat）。
思考題
(1)為什麼在酶液製備過程中要進行脫鹽處理？
(2)試分析影響實驗結果的因素。