(2)如果提取液顏色較深，需以1.0mL 2mol/L HCl代替1g/L 2,4-二硝基苯肼溶液，作為本底對照，按相同方法進行顯色沉澱。用樣品反應液的吸光度值減去對照反應液的吸光度值，再查標準曲線進行計算。
思考題
丙酮酸測定過程中為什麼要加入NaOH溶液？
Ⅲ.丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶活性的測定
目的要求
學習果蔬組織中丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶活性的測定原理和方法。
基本原理
丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）是作用於α-酮酸的羧化酶的一種，需要以焦磷酸硫胺素為輔酶，同時需要Mg2+和Mn2+的參與。PDC可催化丙酮酸轉化生成乙醛。在NADH存在的情況下，乙醛可在乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）作用下被還原形成乙醇，同時，NADH因為被氧化形成NAD+而減少。已知NADH在波長340nm處具有最大光吸收，因此，通過測定反應體係在340nm處的吸光度值的減小變化，可以測定PDC和ADH活性。
材料、儀器及試劑
（一）材料
冬棗、梨、蘋果。
（二）儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、移液器、離心管、水浴鍋、容量瓶（100mL、1000mL）、分光光度計、試管。
（三）試劑
1.0.1mol/L、pH 6.5 MES［2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid］緩衝液
稱取19.52g MES溶於850mL蒸餾水中，用5.0mol/L NaOH溶液調節pH至6.5，用水定容至1000mL。
2.提取緩衝液［含2mmol/L DTT和40g/L PVPP］
稱取30.8mg DTT、4g PVPP，用0.1mol/L、pH 6.5 MES緩衝液溶解，定容至100mL。
3.5mmol/L焦磷酸硫胺素溶液（TPP）
稱取23.0mg焦磷酸硫胺素鹽酸鹽（Thiamine pyrophosphate chloride，TPP），用蒸餾水溶解，定容至10mL，4℃保存。
4.1.6mmol/L NADH溶液
稱取11.4mg還原型輔酶I鈉（NADH-Na2），用蒸餾水溶解並定容至10mL。4℃保存。
5.50mmol/L丙酮酸
稱取55mg丙酮酸鈉，用蒸餾水溶解，定容至10mL，保存於冰箱（4℃）。
6.乙醇脫氫酶（ADH）溶液
用0.1mol/L、pH 6.5 MES緩衝液配製15個酶活單位（U）的ADH溶液，4℃保存。
7.80mmol/L乙醛溶液
取1.12mL 40%乙醛溶液，用蒸餾水稀釋，定容至100mL。
8.50mmol/L MgCl2溶液
稱取476mg無水MgCl2，用蒸餾水溶解，定容至100mL。
實驗步驟
（一）酶液提取
稱取5.0g果蔬組織樣品，置於經預冷的研缽中，加入5.0mL提取緩衝液，研磨成勻漿，於4℃、10000×g離心30min，收集上清液用於PDC和ADH活性的測定。
（二）丙酮酸脫羧酶（PDC）活性測定
反應體係由以下溶液組成：
（1）1.5mL 0.1mol/L、pH 6.5 MES緩衝液；
（2）0.2mL 5mmol/L焦磷酸硫胺素溶液；
（3）0.2mL 50mmol/L MgCl2溶液；
（4）100μL 1.6mmol/L NADH溶液；
（5）0.2mL乙醇脫氫酶溶液；
（6）0.2mL酶提取液；
（7）200μL 50mmol/L丙酮酸溶液。
加入丙酮酸後搖勻，立即計時。在反應15s時開始記錄反應體係在波長340nm處的吸光度值，每隔30s記錄一次，連續測定5min。以蒸餾水作為參比空白進行調零。重複三次。
（三）乙醇脫氫酶（ADH）活性測定
反應體係由以下溶液組成：
（1）2.0mL 0.1mol/L、pH 6.5 MES緩衝液；
（2）100μL 1.6mmol/L NADH溶液；
（3）0.2mL酶提取液；
（4）200μL 80mmol/L乙醛溶液。
加入乙醛後搖勻，立即計時，在反應15s時開始記錄反應體係在波長340nm處的吸光度值，每隔30s記錄一次，連續測定5min。以蒸餾水作為參比空白進行調零。重複三次。
實驗結果與計算
1.測定數據記錄
2.計算結果
記錄反應體係在波長340nm處的吸光度值，製作OD340值隨時間變化曲線，根據曲線的初始線性部分（從時間I到時間F）計算每分鍾吸光度變化值ΔOD340。
思考題
在測定丙酮酸脫羧酶活性時，如何消除酶提取液中乙醇脫氫酶的影響？