正文 實驗25 果蔬組織乙醇發酵代謝的測定(1 / 3)

果蔬組織中的葡萄糖經過糖酵解後產生的丙酮酸進入三羧酸循環,再經過一係列的代謝過程後,最終將形成二氧化碳和水。貯藏中的果蔬不斷地進行著呼吸作用。但是,當貯藏環境中的氧供給不足或出現其它不良條件時(如不適宜的氣調貯藏、塑料薄膜包裝;果皮透性不良,組織內的氧化酶活性下降等),果蔬就會出現無氧呼吸,糖酵解產生的丙酮酸發生脫羧反應生成乙醛,乙醛再被NADH還原為乙醇(即酒精發酵),或直接還原為有機酸(如乳酸發酵)。乙醇發酵反應式如下。

第一步反應是丙酮酸在丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)作用下生成乙醛。

第二步反應是乙醛在乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)作用下還原為乙醇。

乙醛和乙醇是果蔬中天然香味化合物成分之一,幾乎存在於每種果蔬中,並且在果蔬後熟過程中不斷積累。然而,過多積累的乙醛和乙醇卻能使果蔬采後生理代謝過程發生紊亂,產生異味,影響正常品質。因此,測定貯藏過程果蔬組織中乙醛、乙醇及其代謝相關酶活性,對於了解果蔬采後生理代謝過程具有重要意義。

Ⅰ.果蔬組織中乙醛、乙醇含量的測定

方法1氣相色譜法測定乙醛、乙醇含量

目的要求

學習利用氣相色譜法測定果蔬組織中乙醛、乙醇含量的原理和方法。

基本原理

利用乙醛(acetaldehyde)和乙醇(ethanol)的易揮發性,頂空收集果蔬組織釋放的乙醛、乙醇氣體,通過氣相色譜柱分離後,可以進行檢測。

材料、儀器及試劑

(一)材料

蘋果、梨、鮮棗。

(二)儀器及用具

研缽、電子天平、容量瓶(100mL、1000mL)、樣品瓶(20mL,帶密封橡膠塞)、移液器、氣相色譜儀、色譜工作站、恒溫箱、計時器、漏鬥、濾紙。

(三)試劑

40%乙醛、無水乙醇,均為分析純試劑。

實驗步驟

(一)氣相色譜配置及工作條件

氣相色譜配置有氫火焰離子化檢測器(FID)和Carbowax(5%)-Carbopac 60/80填充柱,柱長2m,內徑2mm。載氣N2流速20mL/min。進樣溫度150℃,柱溫85℃,檢測溫度200℃。

(二)製作標準曲線

用蒸餾水分別配製0、20、40、60、80、100μL/L的乙醛(或乙醇)溶液。取5.0mL乙醛(或乙醇)各溶液,分別移入到20mL樣品瓶中,用橡膠塞密封後在60℃保溫1h,頂空取1.0mL氣體,在氣相色譜儀進樣口上進樣測定,確定乙醛(或乙醇)的出峰時間,製作乙醛(或乙醇)溶液濃度-峰麵積標準曲線。

(三)提取

稱取20.0g果肉樣品,加10.0mL蒸餾水研磨後,轉入到100mL容量瓶中,用蒸餾水衝洗研缽,一並轉入容量瓶,定容至刻度線,提取10min後,過濾,濾液用於乙醛和乙醇含量的測定。

(四)測定

取5.0mL提取液,移入到20mL樣品瓶中,用橡膠塞密封後在60℃保溫1h,頂空取1.0mL氣體,用氣相色譜測定。根據標準曲線,利用麵積外標法,計算樣品提取液中乙醛(或乙醇)的濃度。重複三次。

實驗結果與計算

根據樣品提取液中乙醛或乙醇的濃度,計算每克果蔬組織中含有的乙醛或乙醇的質量,表示為μg/g。

注意事項

(1)還可選擇弱極性毛細管色譜柱進行測定。

(2)本實驗中,將提取液移入到密閉樣品瓶中,在60℃保溫後形成乙醛(或乙醇)蒸汽,然後頂空取氣進樣測定。根據峰麵積和標準溶液中乙醛或乙醇濃度標準曲線,利用麵積外標法確定樣品提取液中乙醛(或乙醇)含量。

思考題

分析影響果蔬組織中乙醛、乙醇測定的主要因素。

方法2重鉻酸鉀氧化法測定乙醇含量

目的要求

學習利用重鉻酸鉀氧化、滴定法測定果蔬組織中乙醇含量的原理和方法。

基本原理

一般剛采收的果蔬乙醇含量極少[約0.04%(質量分數)左右],在貯藏中乙醇的含量逐漸增加。蘋果中乙醇含量達到0.3%(質量分數)時就能引起果蔬的傷害。因此,果蔬中乙醇的積累和變化情況,可以作為判斷貯藏效果的依據。

重鉻酸鉀氧化法是測定果蔬中微量乙醇的常用方法。在濃硫酸存在的條件下,過量的重鉻酸鉀能將乙醇氧化為乙酸,而自身被還原成鉻的硫酸鹽。氧化乙醇後剩餘的重鉻酸鉀可與碘化鉀發生反應,生成遊離的碘。遊離的碘再被硫代硫酸鈉滴定還原,根據滴定時消耗的硫代硫酸鈉的量,可以推導、計算出氧化乙醇所消耗的重鉻酸鉀量,從而計算出果蔬中乙醇的含量。

材料、儀器及試劑

(一)材料

蘋果、棗、梨、柑橘等。

(二)儀器及用具

電子天平、研缽、燒杯、容量瓶(100mL、1000mL)、圓底燒瓶(250mL)、移液管(5mL、10mL、20mL)、酒精燈、石棉網、鐵架台、漏鬥、蒸餾頭、冷凝管、磨口三角瓶(250mL、500mL)、滴定管(25mL)、量筒(20mL)、洗瓶、橡膠塞。

(三)試劑

1.濃硫酸

2.碘化鉀