思考題
過高的H2O2濃度會對過氧化氫酶活性產生怎樣的影響？
Ⅳ.超氧化物歧化酶活性測定
目的要求
學習果蔬組織中超氧化物歧化酶活性的測定原理和方法。
基本原理
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）普遍存在於動植物與微生物體內。SOD是含金屬輔基的酶。高等植物有兩種類型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。SOD能夠清除超氧自由基（O-2），它與CAT、POD等酶協同作用來防禦活性氧或其它過氧化物自由基對細胞膜係統的傷害，從而減少自由基對有機體的毒害。
超氧陰離子自由基（O-2）是生物細胞某些生理生化反應常見的中間產物。SOD能通過歧化反應清除生物細胞中的超氧陰離子自由基，生成H2O2和O2。H2O2再由CAT進一步催化生成H2O和O2。
由於超氧自由基非常不穩定，壽命極短，一般利用間接方法測定SOD活性。本實驗依據SOD抑製氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性的大小。在有氧化物質存在時，核黃素可在光照條件下被還原。被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產生O-2。當加入NBT後，在光照條件下O-2又可將NBT還原為藍色的甲腙，後者在560nm處有最大光吸收。
當加入SOD時，SOD可通過清除O-2而抑製NBT的光還原反應，使藍色甲腙生成速度減慢。於是，進行光還原反應後，反應液藍色越深，說明酶的活性越低，反之酶的活性越高。抑製NBT光還原相對百分率與酶活性在一定範圍內呈正相關關係，據此可以計算出酶活性的大小。常常將抑製50%的NBT光還原反應時所需的酶量作為一個酶活性單位（U）。
材料、儀器及試劑
（一）材料
蘋果、梨、番茄等。
（二）儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、分光光度計、計時器、移液器、離心管、光照箱（反應試管處日光燈照度為4000lx）、指形玻璃管、容量瓶（100mL、200mL、1000mL）。
（三）試劑
1.提取液
（1）0.1mol/L、pH 7.8磷酸鈉緩衝液
配製方法見附錄1。
（2）提取緩衝液
稱取77mg DTT、5g PVP，加入0.1mol/L、pH 7.8磷酸緩衝液，定容至100mL，搖溶，即得提取緩衝液（含5mmol/L DTT和5% PVP），低溫（4℃）貯藏備用。
2.50mmol/L、pH 7.8磷酸鈉緩衝液
配製方法見實驗23Ⅰ。
3.130mmol/L-蛋氨酸（MET）溶液
稱取1.94g L-蛋氨酸，用50mmol/L、pH 7.8磷酸緩衝液溶解，定容至100mL，充分混勻（現用現配）。低溫保存，可使用1～2d。
4.750μmol/L氮藍四唑（NBT）溶液
稱取61.3mg NBT，用蒸餾水溶解，定容至100mL，充分混勻（現配現用）。低溫避光保存，可用2～3d。
5.100μmol/L EDTA-Na2溶液
稱取37.2mg EDTA-Na2，用蒸餾水溶解，定容至100mL，使用時稀釋100倍。低溫避光保存可用8～10d。
6.20μmol/L核黃素溶液
稱取75.3mg核黃素，用蒸餾水溶解，定容至100mL，使用時稀釋100倍。低溫避光保存，即用黑紙將裝有該液的棕色瓶包好，隨用隨配。
實驗步驟
（一）酶液製備
稱取5.0g果蔬樣品，置於研缽中，加入5.0mL提取緩衝液，在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉入到離心管中，於4℃、12000×g離心30min，收集上清液，低溫保存備用。
（二）活性測定
用5支指形玻璃管進行測定。按照所列內容加入各種溶液。注意最後加入核黃素溶液。其中3支為測定管，2支為對照管。混勻後將1支對照管置於暗處，其它各管置於4000 lx日光燈下反應15min後立即取出，置於暗處終止反應。以不照光管做空白參比調零，於560nm處分別測定其它各管的吸光度值。
實驗結果與計算
1.測定數據記錄
2.計算結果
顯色反應後，分別記錄樣品管反應混合液的吸光度值（ODS）和照光對照管反應混合液的吸光度值（ODC）。以每分鍾每克果蔬組織（鮮重）的反應體係對氮藍四唑（NBT）光化還原的抑製為50%為一個SOD活性單位（U）表示。
也可以每分鍾反應體係對氮藍四唑（NBT）光化還原的抑製為50%時所需的酶量為一個SOD活性單位（U）。
注意事項
(1)需要通過預實驗，摸索顯色反應所需的時間。
(2)當測定樣品數量較大時，可在臨用前根據用量將各試劑（酶液和核黃素除外）按比例混合後一次加入2.6mL，然後依次加入核黃素和酶液，使終濃度不變，其餘各步驟與上相同。
(3)要求各管受光情況一致，所有反應管應排列在與日光燈管平行的直線上。反應溫度控製在25℃左右，視酶活性高低適當調整反應時間。溫度較高時，光照時間應縮短；溫度較低時，光照時間相應延長。
(4)所用指形管要潔淨透明，透光性好。用淺底廣口的小玻璃皿照光效果更好。
思考題
(1)在SOD測定中為什麼設照光和不照光兩個對照管？
(2)影響本實驗準確性的主要因素是什麼？應如何克服？