果蔬組織在衰老過程中，或在受到逆境脅迫（如冷害、病蟲害侵襲等）時，細胞內自由基代謝平衡往往被破壞，自由基大量積累並引發或加劇脂質過氧化作用，造成細胞質膜係統的損傷。自由基是具有未配對價電子的原子或原子團，化學性質非常活潑。通過呼吸作用進入生物體內的氧分子，隻接受一個電子，轉變為超氧陰離子自由基（O-2），O-2能衍生成為H2O2、羥自由基（OH-）、單線態氧（1O2）等。羥自由基可以引發細胞質膜上不飽和脂肪酸的脂質（RH）過氧化反應，產生一係列活性氧自由基，如脂質自由基（R·）、脂氧自由基（RO·）、脂過氧自由基（ROO·）和脂過氧化物（ROOH）等活性氧自由基。如果細胞中缺乏清除自由基的酶或物質時，機體就會受到各種自由基的傷害。實際上，果蔬體內存在著完整的活性氧清除係統，包括各種抗氧化酶和抗氧化劑。果蔬體內具有酶促和非酶促兩類過氧化物防禦係統。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等是酶促防禦係統的重要保護酶。抗壞血酸、生育酚和還原型穀胱甘肽（GSH）等是非酶促防禦係統中的重要抗氧化劑。因此，O-2、H2O2、OH-等活性氧水平及其清除酶和清除劑的含量可作為衡量果蔬衰老程度的生理生化指標。
Ⅰ.超氧陰離子產生速率的測定
目的要求
學習果蔬組織中超氧陰離子產生速率的測定原理和方法。
基本原理
超氧陰離子（O-2）能與羥胺反應，生成NO-2，NO-2能與對氨基苯磺酸和α-萘胺反應生成粉紅色的偶氮染料，該染料在波長530nm處具有顯著光吸收。因此，利用羥胺氧化的方法可以測定果蔬組織中超氧陰離子的產生速率。
可用KNO2製作標準曲線，以NO-2濃度乘以2作為O-2濃度，計算樣品中O-2產生速率。
材料、儀器及試劑
（一）材料
蘋果、梨、番茄、桃等。
（二）儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、移液器、離心管、試管、水浴鍋、容量瓶（100mL、1000mL）、分光光度計。
（三）試劑
1.50mmol/L、pH 7.8磷酸鈉緩衝液
2.提取緩衝液（含1mmol/L EDTA，0.3% Triton X-100和2% PVP）
稱取29.2mg EDTA、2g PVP，取0.3mL Triton X-100，加入到50mmol/L、pH 7.8磷酸緩衝液中，溶解定容至100mL，混勻。
3.1mmol/L鹽酸羥胺溶液
稱取7.0mg鹽酸羥胺，用蒸餾水溶解，定容至100mL。
4.17mmol/L對氨基苯磺酸溶液
稱取294.4mg對氨基苯磺酸，用冰醋酸-水（3∶1，體積分數）溶解，並定容至100mL。
5.7mmol/L α-萘胺溶液
稱取100.2mg α-萘胺，用冰醋酸-水（3∶1，體積分數）溶解，並定容至100mL。
6.100μmol/L KNO2標準液
稱取85.1mg KNO2，用蒸餾水溶解、定容至100mL，即為10mmol/L KNO2溶液。取1.0mL該溶液，稀釋至100mL，即為100μmol/L KNO2標準液。根據O-2與羥胺的反應式，可計算得此溶液相當於200μmol/L O-2溶液。
實驗步驟
（一）製作標準曲線
取7支試管，編號，分別加入各種試劑，搖勻。在25℃保溫1h。取出後分別加入1.0mL 17mmol/L對氨基苯磺酸溶液和1.0mL 7mmol/L α-萘胺溶液，混勻後再於25℃保溫20min進行顯色反應。以0號管為參比空白進行調零，立即測定顯色液在波長530nm處吸光度值。以吸光度值為縱坐標、超氧陰離子的物質的量（μmol）為橫坐標，製作標準曲線。
（二）提取
稱取5.0g果蔬樣品，加入5.0mL提取緩衝液，在冰浴條件下研磨勻漿，於12000×g、4℃離心20min，收集上清液進行測定。
（三）測定
取1.0mL上清液，加入1.0mL 50mmol/L、pH 7.8磷酸緩衝液和1.0mL 1mmol/L的鹽酸羥胺溶液，搖勻後於25℃保溫1h。取出後加入1.0mL 17mmol/L對氨基苯磺酸溶液和1.0mL 7mmol/L α-萘胺溶液，混勻後於25℃保溫20min進行顯色反應。按照與製作標準曲線相同的方法立即測定顯色液在波長530nm處吸光度值。
按照上述方法，但不進行保溫1h的測定作為參比對照。重複三次。
實驗結果與計算
根據樣品管顯色液與對照管顯色液吸光度值的差值，從標準曲線上查出相應的超氧陰離子的物質的量，以每分鍾每克果蔬組織（鮮重）產生的超氧陰離子的物質的量作為超氧陰離子的產生速率，表示為nmol/min·g。
注意事項
(1)也可以在顯色反應保溫後加入3.0mL正丁醇，充分搖動，靜置分層後取正丁醇相在波長530nm處測定吸光度值。
(2)若樣品中含有大量葉綠素，可在樣品與羥胺反應後，加入等體積的乙醚萃取葉綠素，然後再加入對氨基苯磺酸和α-萘胺進行顯色反應。
思考題
試討論本試驗設置的參比對照可以消除哪些影響因素？
Ⅱ.過氧化氫含量的測定
目的要求
學習果蔬組織中過氧化氫含量的測定原理和方法。
基本原理
果蔬體內積累的H2O2可以直接或間接地導致細胞膜脂質過氧化損害，加速細胞的衰老和解體。但是，在受到病原菌侵染或受到不良環境脅迫時，果蔬體內迅速積累的H2O2參與果蔬抗病性和抗逆性啟動和誘導過程。因此，了解果蔬組織中H2O2的代謝具有十分重要的意義。