正文 實驗22 果蔬組織乙烯生物合成代謝的測定(1 / 3)

1979年,Adams和Yang等發現了果蔬中乙烯(ethylene,ETH)的生物合成途徑。乙烯生物合成的前體物質是甲硫氨酸(MET),甲硫氨酸轉化成中間代謝產物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM在1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶的作用下形成乙烯的直接前體物質1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC),ACC進一步在ACC氧化酶的作用下形成乙烯。除了轉變生成乙烯外,ACC還能與丙二酸結合形成1-丙二酰基環丙烷-1-羧酸(MACC),這是結合態的ACC,這一ACC代謝支路可以調節組織中遊離ACC的水平。

乙烯是重要的成熟衰老激素,與果蔬采後生理活動過程密切相關。在研究果蔬中乙烯生物合成代謝時,往往需要綜合考慮整個代謝過程的動態變化情況,從更深層次上理解乙烯的生物合成機製。

Ⅰ.乙烯釋放量的測定

目的要求

了解乙烯的作用及其生物合成途徑,掌握果蔬組織中乙烯釋放量的測定方法。

基本原理

乙烯是重要的植物內源激素之一,以氣體形式存在。乙烯能促進果蔬的後熟衰老過程。在果蔬貯藏實踐中,常常要檢測果蔬中內源乙烯的釋放量。通常,先收集果蔬釋放出的乙烯氣體樣品,利用氣相色譜法測定氣體樣品中乙烯的濃度,然後計算出果蔬乙烯釋放量。

氣相色譜具有靈敏度高、穩定性好等優點。色譜儀中的分離係統包括固定相和流動相。由於固定相和流動相對各種物質的吸附或溶解能力不同,因此物質的分配係數(或吸附能力)不一樣。當含混合物的待測樣(含乙烯的混合氣體)在流動相(即載氣,通常為N2)的帶動下,與固定相不斷地發生分配、吸附、解吸和再分配、再吸附解吸的過程,最後依照分配係數大小順序依次被分離後,利用氫火焰離子化檢測器(FID)可檢測到混合氣體中所含的乙烯。檢測信號的強弱可以反映出待檢物質的含量,在記錄儀上呈現色譜峰。要使待測物得到充分的分離,就需要一種合適的固定相。乙烯往往與乙炔、乙烷難以分離,而采用GD×502、Porapak 80-100等作為固定相則可得到比較滿意的效果。

材料及儀器

(一)材料

蘋果、梨、香蕉、番茄等果蔬。

(二)儀器及用具

帶有空心橡膠塞的玻璃容器(塞上帶有取氣口)、玻璃樣品瓶(300mL,帶有橡膠塞)、注射器(1mL),天平(600~1000g)、量筒(1000mL)、標準乙烯、標準N2、氣相色譜儀(GC7890F,上海天美公司)。

實驗步驟

(一)氣相色譜配置及工作條件

氣相色譜配置不鏽鋼填充柱、氫火焰離子化檢測器(FID)。色譜柱長2m,內徑2mm,填充物質Porapak 80-100。載氣N2流速18mL/min,燃氣H2流速21mL/min,助燃氣體空氣流速150mL/min。進樣溫度120℃,柱溫60℃,檢測溫度150℃。氣相色譜配有色譜工作站,利用N2000色譜軟件進行數據處理。

(二)乙烯標準曲線的製作

取300mL樣品瓶,倒置,將氮氣導管伸入到瓶中充分通氣,以將瓶中空氣排出。經長時間排氣後,用橡膠塞密封瓶口。再往樣品瓶中注射加入一定量的標準乙烯,分別配製含量為0.0005%、0.001%、0.0015%、0.002%(體積分數)的乙烯氣體,充分搖動。然後,用注射器從容器橡膠塞上取1.0mL氣體,在氣相色譜儀上進樣測定,確定乙烯出峰時間,以峰麵積為橫坐標、乙烯濃度為縱坐標製作標準曲線。

(三)氣體收集與測定

將玻璃容器打開,倒扣放置或用風扇吹風,使容器中氣體與空氣平衡。然後放上果實1kg左右,在室溫下密閉1h。用注射器從容器橡膠塞取氣口中頂空取1.0mL氣體,在氣相色譜儀上進樣測定。經色譜儀檢測後得到色譜圖,加載標準曲線後(麵積外標法),經過微機處理,即可得到進樣氣體乙烯濃度。

(四)密閉空間體積測量

通過排水法測定放置果蔬的幹燥器中剩餘空間體積(即密閉空間體積)。

實驗結果與計算

乙烯釋放量以每小時每千克果蔬釋放的乙烯的體積表示(μL/kg·h)。

注意事項

能否成功檢測到乙烯,與果蔬所處的生理狀態有關,處於呼吸躍變前期的果實(如開始轉黃的杏子、桃、蘋果、梨等)乙烯釋放量較高,而成熟度較低的果實乙烯釋放量小,不易檢測得到。

思考題

(1)利用氣相色譜法測定果蔬中乙烯釋放量的原理是什麼?

(2)利用頂空法收集氣體樣品和進樣測定過程中應注意什麼問題?

Ⅱ.ACC含量的測定

目的要求

了解1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)在乙烯生物合成過程中的作用,學習果蔬組織中ACC含量的測定方法。

基本原理

ACC可被NaClO的堿性溶液氧化產生乙烯。乙烯在常溫下是氣體物質,可直接用氣相色譜法測定,然後根據ACC向乙烯轉化的效率,就可計算出果蔬組織中ACC的含量。

材料、儀器及試劑

(一)材料

梨、蘋果、番茄等。

(二)儀器及用具

研缽、高速冷凍離心機、移液器、水浴鍋、旋渦混合儀、旋轉蒸發儀、樣品瓶(20mL,帶有密封橡膠塞)、離心管、刻度試管(25mL)、氣相色譜儀。

(三)試劑

1.95%乙醇

2.85%乙醇溶液

3.25mmol/L HgCl2溶液

稱取67.88mg HgCl2,用蒸餾水溶解,稀釋至10mL。