稱取1.0mg S-腺苷蛋氨酸（SAM，MW=399.4），0.1mL 1mmol/L磷酸吡哆醛溶液，用50mmol/L、pH 8.0 HEPES-KOH緩衝液溶解，定容至10mL，即得反應緩衝液。
5.5% NaClO-飽和NaOH混合液（NaClO∶NaOH=2∶1，體積比）
6.25mmol/L HgCl2溶液
配製方法見本實驗Ⅱ。
實驗步驟
（一）酶液提取
稱取5.0g果蔬組織，加入5.0mL提取緩衝液，在冰浴條件下研磨勻漿後於4℃、12000×g離心30min，收集上清液即為酶提取液。
（二）活性測定
將0.5mL酶提取液和1.5mL反應緩衝液加入到20mL樣品瓶中，用橡膠塞密封樣品瓶後，在30℃水浴中保溫1h。然後注射加入0.1mL 25mmol/L HgCl2溶液以終止反應，並置於冰浴10min平衡溫度，再用注射器加入0.2mL經冰浴預冷的5% NaClO-飽和NaOH混合液（NaClO∶NaOH=2∶1，體積比），迅速振蕩5s後，放回冰浴平衡5min，頂空取1.0mL氣體測定乙烯釋放量。重複三次。
實驗結果與計算
根據氣相色譜法測得頂空氣體中乙烯含量，以乙烯的產生速率表示每小時每克果蔬樣品組織（鮮重）中ACC合成酶活性，即為nmol/h·g。
注意事項
HEPES，即N-（乙-羥乙基）呱嗪-N-2-乙烷磺酸［N-(2-hydroxylethyl)-piperazine-N-2-ethanesulfonicacid］，相對分子質量238.31。HEPES緩衝液具有較強的緩衝能力，使用的最終濃度一般為10～50mmol/L，可以根據緩衝能力的要求而定。通常用蒸餾水溶解HEPES，再用1mol/L NaOH溶液調節pH至7.5～8.0，然後將溶液稀釋、配製成1mol/L儲存液，過濾除菌，分裝小瓶後在4℃保存。由於HEPES價格比較昂貴，通常可以利用50mmol/L、pH 8.0磷酸鉀緩衝液代替。
思考題
哪些因素對ACC合成酶活性的測定具有重要影響？
Ⅳ.ACC氧化酶活性測定
目的要求
了解ACC氧化酶在乙烯生物合成過程中的作用，學習果蔬組織中ACC氧化酶活性的測定原理和方法。
基本原理
ACC氧化酶（ACO）能催化1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）轉化形成乙烯。通過測定ACO催化產生的乙烯釋放量的大小可以反映ACO的催
化能力。
材料、儀器及試劑
（一）材料
梨、蘋果、番茄等。
（二）儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、移液器、水浴鍋、旋渦混合儀、旋轉蒸發儀、樣品瓶（20mL，帶有密封橡膠塞）、離心管、氣相色譜儀、CO2氣體。
（三）試劑
1.0.1mol/L、pH 7.5 Tris-鹽酸緩衝液
母液A（0.2mol/L Tris）：稱取24.2g三羥甲基氨基甲烷（Tris），溶解、定容至1000mL。
母液B（0.2mol/L HCl）：取16.67mL濃鹽酸，加入到蒸餾水中，稀釋至1000mL。
取50mL母液A，加入39.9mL母液B混合，待冷卻至室溫時，調節pH至7.5，再稀釋至100mL。
2.提取緩衝液
取10mL甘油，稱取5gPVP、77.1mg DTT、648mg抗壞血酸鈉（C6H7O6Na·H2O）和2.78mg FeSO4·7H2O，用0.1mol/L、pH 7.5 Tris-鹽酸緩衝液溶解，並定容至100mL，即為提取緩衝液［含10%甘油（體積分數）、5% PVP、5.0mmol/L DTT、30mmol/L抗壞血酸鈉和0.1mmol/L FeSO4］。
3.反應緩衝液
取10mL甘油、648mg抗壞血酸納（C6H7O6Na·H2O）、20.2mg ACC和2.78mg FeSO4·7H2O，溶解到0.1mol/L、pH 7.5 Tris-鹽酸緩衝液中，並定容至100mL，即為反應緩衝液［含10%甘油（體積分數）、30mmol/L抗壞血酸鈉、2.0mmol/L ACC和0.1mmol/L FeSO4］。
實驗步驟
（一）酶液提取
稱取5.0g果肉組織，加入5.0mL提取緩衝液，在冰浴條件下研磨勻漿後於4℃、12000×g離心30min，收集上清液即為酶提取液。
（二）酶活性測定
取0.5mL酶提取液和1.5mL反應緩衝液，加入到20mL樣品瓶中，用橡膠塞密封樣品瓶後，向樣品瓶中注射進1.0mL純CO2氣體，在30℃水浴中保溫30min。然後，頂空抽取1.0mL氣體測定乙烯釋放量。
實驗結果與計算
根據氣相色譜法測得頂空氣體中乙烯含量，以乙烯的產生速率表示每小時每克果蔬樣品組織（鮮重）中ACC氧化酶活性，即為nmol/h·g。
注意事項
離體的ACC氧化酶活性需要CO2的激活，故在保溫前應將CO2氣體加入到樣品瓶中，使其濃度達到5%（體積分數）左右。另外，也可在反應緩衝液中加入NaHCO3溶液（濃度達到30mmol/L），也能產生激活酶活性所需的CO2。
思考題
本實驗產生誤差的主要來源有哪些？