4.5%NaClO-飽和NaOH混合液（NaClO∶NaOH=2∶1，體積比）
5.1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）
實驗步驟
（一）ACC的提取與製備
稱取5.0g果蔬樣品，置於研缽中，稍加研磨後，轉入到試管中，加入10mL 95%乙醇溶液，煮沸浸提20min，冷卻後於10000×g離心15min，收集上清液。再向殘渣中加入10mL 80%乙醇，於70℃浸提30min，離心，收集上清液。合並兩次浸提液，用旋轉蒸發儀在40℃條件下將浸提液蒸發至幹。向蒸發殘留物中加入2.0mL蒸餾水振蕩溶解，即為ACC製備液，於-20℃保存備用。
（二）ACC含量的測定
取1.0mL ACC製備液，置於容積為20mL的樣品瓶中，加入40μL 25mmol/L HgCl2溶液，用橡膠塞密封樣品瓶，冰浴10min使溫度平衡。再通過注射加入0.2mL經冰浴預冷的5% NaClO-飽和NaOH混合液（NaClO∶NaOH=2∶1，體積比），迅速振蕩5s後，放回冰浴平衡5min，頂空取1.0mL氣體，用氣相色譜法測定乙烯生成量。
（三）ACC轉化率的計算
取同一處理果蔬樣品ACC提取液兩份，其中一份加入20μL 0.1mmol/L ACC標準品作為內標物，按照前麵敘述的方法進行測定。兩份樣品乙烯生成量之差即為所添加的ACC轉化為乙烯的量。此外，根據所添加ACC的量，計算出理論上能夠形成的乙烯的量，就可以計算出該處理的ACC轉化率（R），重複三次。計算公式：
R=乙烯實際產生量/乙烯理論產生量×100%
實驗結果與計算
1.測定數據記錄
2.計算結果
根據氣相色譜法測得頂空氣體中乙烯含量，計算每克果蔬樣品（鮮重）中ACC的含量，以nmol/g mF表示。
注意事項
(1)果蔬組織含水量較高，因此在提取ACC時所用的乙醇的濃度較高。
(2)某些果蔬果肉組織色素含量很多，需要進行去除色素的操作。可向蒸發殘留物中加入1mL氯仿，振蕩2min以溶解色素。再加入2.0mL蒸餾水振蕩2min，於4℃過夜，再經8000r/min離心10min分相，棄去氯仿層，水相即為ACC製備液。
(3)按照前麵的方法測定的是遊離的ACC含量。實際上，利用ACC製備液還可測定結合態的ACC（即MACC）含量。取1.0mL ACC製備液，加入0.2mL 12mol/L鹽酸，於沸水浴中加熱3h。冷卻後加入1.2mL 2mol/L NaOH溶液中和。然後，按照測定ACC的方法進行測定，即得總的ACC含量。MACC含量為總ACC含量減去遊離ACC含量。
(4)氯化汞，別名升汞，分子式HgCl2，相對分子質量271.52。為無色或白色結晶及顆粒粉末，劇毒。溶於水、醇、醚、丙酮和甲醇，水溶液呈酸性。常溫時微量蒸發，遇光逐漸分解生成氯化亞汞。汞離子可使含巰基的酶喪失活性，失去功能，還能與酶分子中的氨基、二巰基、羧基、羥基以及細胞內的磷酰基結合，引起相應的損害，因此要小心使用。
思考題
(1)在ACC測定過程中應注意哪些問題？
(2)ACC的轉化率的測定受哪些因素的影響？
Ⅲ.ACC合成酶活性的測定
目的要求
了解ACC合成酶在乙烯生物合成過程中的作用，學習果蔬組織中ACC合成酶活性的測定原理和方法。
基本原理
ACC合成酶（ACS）能催化S-腺苷蛋氨酸（SAM）形成1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）。通過測定ACS催化形成的ACC的量，就可以反映ACC合成酶活性。
材料、儀器及試劑
（一）材料
梨、蘋果、番茄等。
（二）儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、移液器、水浴鍋、旋渦混合儀、旋轉蒸發儀、樣品瓶（20mL，帶有密封橡膠塞）、離心管、氣相色譜儀。
（三）試劑
1.0.1mol/L、pH 8.0磷酸鉀緩衝液
配製方法見附錄1。
2.提取緩衝液（含1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF、4mmol/L DTT、3% PVPP和10μmol/L磷酸吡哆醛）。
稱取24.7mg磷酸吡哆醛（Mr=247.1），溶解，用100mmol/L、pH 8.0磷酸鉀緩衝液定容至100mL，混勻，即為1mmol/L磷酸吡哆醛溶液。
稱取29.2mg乙二胺四乙酸（EDTA）、17.4mg苯甲基磺酰氟（PMSF）、61.7mg二硫蘇糖醇（DTT）和3g聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），取1mL 1mmol/L磷酸吡哆醛溶液，加入到0.1mol/L、pH 8.0磷酸鉀緩衝液中，定容至100mL，混勻，即為提取緩衝液。
3.50mmol/L、pH 8.0 HEPES-KOH緩衝液
稱取4.77mg N-(乙-羥乙基)呱嗪-N-α-乙烷磺酸（HEPES，MW=238.31），溶於16mL蒸餾水中，用2mol/L KOH溶液調節pH至8.0，再稀釋至20mL，過濾後分裝，4℃保存，即為1mol/L HEPES-KOH儲備液。
取5.0mL 1mol/L HEPES-KOH儲備液，用蒸餾水稀釋至100mL，混勻，即為50mmol/L、pH 8.0 HEPES-KOH緩衝液。
4.反應緩衝液（含250μmol/L SAM和10μmol/L磷酸吡哆醛）