目的要求
了解脂氧合酶的作用,掌握果蔬組織中脂氧合酶活性的測定方法。
基本原理
脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一種含非血紅素鐵的蛋白質,專一催化具有順、順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸的加氧反應,生成具有共軛雙鍵的過氧化物。脂氧合酶在植物中普遍存在,其作用的底物主要為來自細胞質膜的多元不飽和脂肪酸,如亞油酸、甲基亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等。脂氧合酶與果蔬細胞脂質的過氧化作用、後熟衰老過程的啟動和逆境脅迫、傷誘導、病原侵染信號的產生和識別等關係密切,被認為是引起果蔬後熟衰老的一類重要的酶。
脂氧合酶能催化含有順、順-1,4-戊二烯結構的多不飽和脂肪酸的加合氧分子反應,生成的初期產物具有共軛二烯結構,產物中的共軛雙鍵在波長234nm處具有特征吸收。因此,利用分光光度計法可以測定脂氧合酶活性大小。
材料、儀器及試劑
(一)材料
芒果、番茄、桃、獼猴桃等。
(二)儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、移液器、離心管、紫外分光光度計、容量瓶(100mL、1000mL)、試管、計時器。
(三)試劑
1.亞油酸鈉溶液
方法一:稱取亞油酸鈉(Sigma產品),直接配製0.1mol/L亞油酸鈉溶液。
方法二:取0.5mL亞油酸(化學純),加入到10mL蒸餾水中,再加入0.25mL Tween-20,搖勻。再逐滴滴加1mol/L NaOH溶液,搖動至溶液變得清亮。然後用蒸餾水稀釋至100mL,即為0.5%(體積分數)亞油酸鈉溶液。
2.0.1mol/L、pH 6.8磷酸鈉緩衝液
配製方法見附錄1。
3.提取緩衝液(含1% Triton X-100和4% PVPP)
取1mL Triton X-100和4g PVPP,加入到100mL 0.1mol/L、pH 6.8磷酸緩衝液中,搖勻,置於4℃冰箱預冷。
4.0.1mol/L、pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩衝液
配製方法見實驗19。
實驗步驟
(一)酶液提取
稱取5.0g果蔬組織置於研缽內,加入5.0mL經4℃預冷的提取緩衝液,在冰浴條件下研磨勻漿,然後轉入離心管於4℃、12000×g離心30min,收集上清液用於脂氧合酶活性測定。
(二)活性測定
方法一:取2.75mL 0.1mol/L、pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩衝液,加入50μL 0.1mol/L亞油酸鈉溶液,在30℃保溫10min,加入200μL粗酶液,混勻。以蒸餾水為參比調零,在反應15s時開始記錄反應體係在波長234nm處吸光度值,為初始值,然後每隔30s記錄一次,連續測定,至少獲取6個點的數據。重複三次。
方法二:取2.7mL 0.1mol/L、pH 6.8磷酸鈉緩衝液,加入100μL 0.5%亞油酸溶液,在30℃保溫10min,再加入200μL粗酶液,混勻,按照上述方法測定混合液在234nm處吸光度值。
實驗結果與計算
1.測定數據記錄
2.計算結果
記錄反應體係在234nm處的吸光度值,製作OD234值隨時間變化曲線,根據曲線的初始線性部分(從時間I到時間F)計算每分鍾吸光度變化值ΔOD234。
脂氧合酶活性還可以每分鍾反應體係在波長234nm處吸光度值變化增加0.01所需的酶量為1個活性單位,單位是0.01ΔOD234/min·mg蛋白質。酶提取液中蛋白質含量可利用考馬斯亮藍染色法(實驗15方法1)進行測定。
注意事項
測定時要控製好體係的溫度和反應時間,同時體係必須保持均相。
思考題
哪些因素影響脂氧合酶活性的測定?