正文 實驗21 果蔬中脂氧合酶活性的測定(1 / 1)

目的要求

了解脂氧合酶的作用,掌握果蔬組織中脂氧合酶活性的測定方法。

基本原理

脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一種含非血紅素鐵的蛋白質,專一催化具有順、順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸的加氧反應,生成具有共軛雙鍵的過氧化物。脂氧合酶在植物中普遍存在,其作用的底物主要為來自細胞質膜的多元不飽和脂肪酸,如亞油酸、甲基亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等。脂氧合酶與果蔬細胞脂質的過氧化作用、後熟衰老過程的啟動和逆境脅迫、傷誘導、病原侵染信號的產生和識別等關係密切,被認為是引起果蔬後熟衰老的一類重要的酶。

脂氧合酶能催化含有順、順-1,4-戊二烯結構的多不飽和脂肪酸的加合氧分子反應,生成的初期產物具有共軛二烯結構,產物中的共軛雙鍵在波長234nm處具有特征吸收。因此,利用分光光度計法可以測定脂氧合酶活性大小。

材料、儀器及試劑

(一)材料

芒果、番茄、桃、獼猴桃等。

(二)儀器及用具

研缽、高速冷凍離心機、移液器、離心管、紫外分光光度計、容量瓶(100mL、1000mL)、試管、計時器。

(三)試劑

1.亞油酸鈉溶液

方法一:稱取亞油酸鈉(Sigma產品),直接配製0.1mol/L亞油酸鈉溶液。

方法二:取0.5mL亞油酸(化學純),加入到10mL蒸餾水中,再加入0.25mL Tween-20,搖勻。再逐滴滴加1mol/L NaOH溶液,搖動至溶液變得清亮。然後用蒸餾水稀釋至100mL,即為0.5%(體積分數)亞油酸鈉溶液。

2.0.1mol/L、pH 6.8磷酸鈉緩衝液

配製方法見附錄1。

3.提取緩衝液(含1% Triton X-100和4% PVPP)

取1mL Triton X-100和4g PVPP,加入到100mL 0.1mol/L、pH 6.8磷酸緩衝液中,搖勻,置於4℃冰箱預冷。

4.0.1mol/L、pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩衝液

配製方法見實驗19。

實驗步驟

(一)酶液提取

稱取5.0g果蔬組織置於研缽內,加入5.0mL經4℃預冷的提取緩衝液,在冰浴條件下研磨勻漿,然後轉入離心管於4℃、12000×g離心30min,收集上清液用於脂氧合酶活性測定。

(二)活性測定

方法一:取2.75mL 0.1mol/L、pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩衝液,加入50μL 0.1mol/L亞油酸鈉溶液,在30℃保溫10min,加入200μL粗酶液,混勻。以蒸餾水為參比調零,在反應15s時開始記錄反應體係在波長234nm處吸光度值,為初始值,然後每隔30s記錄一次,連續測定,至少獲取6個點的數據。重複三次。

方法二:取2.7mL 0.1mol/L、pH 6.8磷酸鈉緩衝液,加入100μL 0.5%亞油酸溶液,在30℃保溫10min,再加入200μL粗酶液,混勻,按照上述方法測定混合液在234nm處吸光度值。

實驗結果與計算

1.測定數據記錄

2.計算結果

記錄反應體係在234nm處的吸光度值,製作OD234值隨時間變化曲線,根據曲線的初始線性部分(從時間I到時間F)計算每分鍾吸光度變化值ΔOD234。

脂氧合酶活性還可以每分鍾反應體係在波長234nm處吸光度值變化增加0.01所需的酶量為1個活性單位,單位是0.01ΔOD234/min·mg蛋白質。酶提取液中蛋白質含量可利用考馬斯亮藍染色法(實驗15方法1)進行測定。

注意事項

測定時要控製好體係的溫度和反應時間,同時體係必須保持均相。

思考題

哪些因素影響脂氧合酶活性的測定?