1553年，當伊麗莎白的弟弟愛德華六世去世，她異母姐姐瑪麗繼位後，伊麗莎白的處境變得危險起來。瑪麗是個狂熱的天主教徒，在她統治期間，英國新教徒遭到迫害，約有300人被處以死刑，她得了個“血腥瑪麗”的稱號。再加上她同西班牙狂熱天主教徒、國王腓力二世不得人心的聯姻，引起了新教徒的強烈反對。
在反叛朝廷的動亂和宗教裁判所的鎮壓的緊張氣氛中，伊麗莎白的生命大有朝不保夕之勢。盡管她按照姐姐的要求表麵上遵從官方的天主教宗教儀式，但是她不可避免地成為旨在推翻政府和恢複新教的各種圖謀的主要人物和明顯的受益人。1554年1月發生懷亞特叛亂後，出於對信奉新教的異母妹妹的忌妒，瑪麗將伊麗莎白逮捕並關進倫敦塔。由於找不出叛逆罪的確鑿證據，兩個月後，她被轉往伍德斯托克監禁。盡管後來獲得釋放，但她始終沒有擺脫涉嫌檢查。
1558年11月17日，瑪麗去世，由於沒留子嗣，她臨終前極不情願地確認伊麗莎白為王位繼承人。伊麗莎白在鍾聲、焰火、愛國遊行以及其他群眾的慶祝活動中登上了王位。
這位新女王麵臨著許多問題：與法國的戰爭、與蘇格蘭和西班牙的緊張關係、政府的財政狀況，最麻煩的是英格蘭的宗教分裂。
伊麗莎白先處理了宗教問題。她上台不久便宣布新教為國教，這使溫和的新教徒滿意，但教徒希望更徹底的改革。盡管有教徒和天主教徒的反對，但伊麗莎白堅守了諾言。
宗教狀況由於她的表妹、蘇格蘭女王瑪麗·斯圖亞特的到來而變得更複雜了。瑪麗被逐出蘇格蘭，避難於英格蘭，但不久她發現自己成了伊麗莎白的階下囚。伊麗莎白的舉動也不是沒有道理的，瑪麗是天主教徒，而且還有很強的呼聲要她接替伊麗莎白成為英格蘭的國王，這就意味著萬一發生成功的起義或暗殺，英格蘭就會出現一個支持天主教的女王。瑪麗在押的19年中，事實上有過幾起反對伊麗莎白的陰謀，並有跡象表明與瑪麗有關。1587年，伊麗莎白勉強簽署了處死令，瑪麗被處死。
宗教衝突給伊麗莎白帶來了危險。1570年，教皇庇護五世開除了她的教籍，聲言要將她廢黜。1580年教皇格列高利八世宣布暗殺她無罪。但這種情況反而有利於伊麗莎白。新教徒害怕天主教在英格蘭複辟，她便把自己包裝成反對複辟的堡壘，從而在英格蘭廣大新教徒中贏得了支持。
當伊麗莎白小心謹慎地使不同信仰的人們相安無事後，她的婚姻問題一下子成為全國民眾關心的大事。女王的婚姻之所以關係重大，不僅有繼承王位的問題，而且還在於國家外交的錯綜複雜。國際上，英格蘭孤立無援，兵力又很弱，急切需要較強的盟國，而通過有利的聯姻可以達到這個目的。一些高貴的人士熱心上門示婚：西班牙的腓力二世，他希望恢複天主教西班牙同英格蘭之間的邦交；還有奧地利的查理大公、瑞典國王埃裏克十四世、安茹公爵亨利（後為法國國王）、阿朗鬆公爵弗朗索瓦等等。
在這個問題上，女王顯示了她少有的外交家天賦，她巧妙地使一個求婚者與另一個求婚者互鬥，而把聯姻的協商拖幾個月甚至幾年；在此刻似乎馬上要點頭應允，而在另一刻又變了卦，發誓要獨身到底。因此，各國宮廷中一向水平很高的陰謀和渴望，在伊麗莎白的左右下經常上升到白熱化程度。然而，童年的經曆和英格蘭地位的狀況使伊麗莎白認識到了權力對自己的重要。宮廷之內爭權奪利的頻繁上演使她懂得了最危險的往往來自最信任的。最後，她設法使所有對她婚姻抱有期待的人都明白：她要永葆童貞，她已經嫁給英格蘭了。
伊麗莎白對外交政策的處理是精明的。早在1560年，她便與蘇格蘭簽訂了《愛丁堡協議》，和平解決了與蘇格蘭的紛爭。她還結束了與法國的戰爭，使兩國關係有了改善。但英格蘭又與西班牙出現了矛盾，伊麗莎白極力避免戰爭。16世紀的西班牙充滿著好戰的天主教主義，戰爭因而不可避免。荷蘭反對西班牙統治的起義起了推動作用，荷蘭起義者大多數是新教徒，當西班牙試圖鎮壓起義時，伊麗莎白給荷蘭以支持。伊麗莎白本人不希望戰爭，但大多數英國人、她的大臣和議會都比她更好戰。當80年代與西班牙開戰時，英國百姓成了伊麗莎白的堅強後盾。