一休雖曾數次應其父召入宮，但從未以皇子自居，他勤奮修行，在船中因聞烏鴉鳴叫而悟道。78歲時，一休遇到盲女藝人森，並與之相愛。1474年，一休81歲時，受後土禦門天皇詔令，擔任大德寺第47代住持，修繕因戰亂而荒廢的寺院。晚年的一休住在現在京都府的酬恩庵，現在該庵被大家叫做“一休寺”。一休禪師去世時，日本已經到了群雄混戰的戰國時代。
後醍醐天皇堅持反對幕府，以恢複天皇權力。早在1324年，後醍醐天皇就秘密籌劃反對幕府的活動，然而計劃被人告密，天皇聲明與此無關才免受牽連。1331年，後醍醐天皇再度製定計劃，然而被寵信的重臣吉田向幕府告密，導致後醍醐天皇不得不逃亡。1333年，鐮倉幕府滅亡，後醍醐天皇利用人們對幕府專權的不滿，中興皇室，史稱“建武中興”。後醍醐天皇決心借鑒中國年號來表明恢複皇權的事實，以劉秀滅王莽複興漢室的“建武”年號，將1334年改元為“建武”，對中央和地方政權和經濟作了改革。但是已經興起的武士對後醍醐天皇未能滿足他們的要求很是不滿，3年後，武士們開始反抗。而足立尊氏也因為天皇沒有封他為征夷大將軍而心存不滿，在打敗後醍醐天皇軍隊後，扶持伴仁親王即位為光明天皇。
後醍醐天皇逃亡到吉野，史稱南朝。楠木正成、新田義貞、北畠親房等都是南朝的名將。足立幕府開創者足立尊氏在京都另立天皇，是為北朝。日本皇室形成大覺寺和持明院兩個流派並立，史稱“一天二帝南北朝”。光明天皇冊封足立尊氏為征夷大將軍，足立幕府開幕。
後醍醐天皇在1339年病死，臨死前天皇左手持法華經，右手按寶劍，遙望北方，並且留下悲壯的遺言：唯願消滅朝敵而致四海太平，縱使埋骨南山，魂魄也要遙望北闕。
九州一直是日本對中國文化往來的重要出發點。南北朝時代，在九州地方的是南朝太宰府“征西將軍”的懷良親王。明初由於不了解日本南北朝分裂對峙的情況，明太祖朱元璋就於1369年派楊宰詔命“日本國王良懷”，希望其鎮撫當時正在中國沿海滋擾的“倭寇”。這裏的“良懷”就是懷良親王。最初，懷良親王將使者一行7人中殺死5人，拘留楊載、吳文化3個月始放回，並且“複寇山東，轉掠溫、台、明州旁海民，遂寇福建沿海郡”。明洪武三年（1370年），明太祖再派官員趙秩攜詔書往見懷良親王。懷良親王同意派人入明朝貢，並歸還明州、台州被擄男女70餘口。然而此後倭患未絕，1381年、1382年明政府又詔諭指出日本“傲慢不恭、縱民為非，將必自殃”，而懷良親王也借助明朝權威來鞏固南朝已經衰微的局勢。
後醍醐天皇出逃時，持有天皇象征的鏡、玉、劍“三神器”。後來經過多次爭奪攻防，南朝勢力衰退，最終在足利義滿擔任征夷大將軍時，南北開始談判，決定繼續實行兩統交替製度，結束了對立57年的南北朝。1392年，南朝的後龜山天皇將“三神器”交給北朝的後小鬆天皇。
後小鬆天皇成為天下一統的第100代天皇，南朝的後龜山天皇則進入大覺寺，被封為上皇。
南北朝結束使皇室又團結在一起。可是事情並非如此簡單，統一後北朝皇室開始反悔，將南朝皇子趕出皇宮。同時又擔心北朝萬一絕後，南朝將來便會複辟，於是“宮家”製度就應運而生了。
南北朝對峙時，互稱對方為“偽朝”。南朝的北畠親房就著述《神皇正統記》，記述從“神代”到後村上天皇之間一千多年的日本曆史，以朱子學“大義名分”，對“亂臣賊子”進行口誅筆伐，主張擁有三種“神器”的南朝為正統，公家、武士應當遵守傳統輔佐正統。