為同治皇帝選立皇後，同樣體現了慈安太後關心小皇帝的慈母之愛。她怕載淳親政以後，年紀太輕，不能勝任繁重的政務，所以得要一位成熟賢淑、識大體，而又能動筆墨的皇後，輔助皇帝。出於這種考慮，她先同載淳商量，征得了載淳的同意，在立後問題上，明確堅持要立載淳滿意的鈕祜祿氏為皇後。皇帝“大婚”之後，慈安太後對皇後鈕祜祿氏更是百般關照，每次皇後來問安、伺膳，她都熱情接待，並屢次催促皇後早早回宮，不必過於拘禮。但她卻沒有保護住皇後，由於慈禧太後的挑撥、幹擾，致使帝後分居，造成了以後的悲劇。在載淳剛死後的幾天裏，也多虧她安慰、開導皇後，才使鈕祜祿氏有了生活的勇氣。
穆宗死後，載湉被立為皇帝，即德宗，亦稱光緒皇帝，但這本非出自慈安太後之願，完全是慈禧太後的主張。由於德宗皇帝即位時年紀尚幼，兩宮皇太後二次垂簾聽政。這時雖然是二人同時訓政，但慈安太後已沒有一分權力。實權都掌握在慈禧太後的手中。在光緒年間，她誠心信奉佛教，在宮中天天以持齋念佛為主要功課。這樣，慈禧太後更覺無所約束，益加肆意弄權，膽大妄為了。光緒一朝，慈安太後日益倦怠不問外事，而慈禧太後則日益振奮，統攝全局大權獨攬。從生活上說，慈安太後崇尚節儉，不事鋪張，吃飯以素食為主。而慈禧太後卻肆無忌憚地揮霍。她在體和殿每日正餐兩頓，每頓飯僅主食就有50多種，菜肴120多樣，每天需用豬、牛、羊、魚、兔肉500多斤，雞鴨100多隻，前前後後要有450多人伺候，花費白銀達千兩。耗費之大，實在驚人。同慈安太後形成了鮮明的對比。
慈禧太後還經常單獨召見大臣，決定大事要事逐漸地也不再告知慈安太後。過去她哪敢這樣做，像同治年間補瑞麟為文華殿大學士這樣的大事，她都要找慈安太後商量，取得慈安太後的同意後才可以實施。此時，慈安太後竟成了可有可無之人。這使慈安太後心內憤憤不平，兩人之間的矛盾也逐漸突出起來。
慈安太後打算勸阻慈禧太後驕橫擅權的獨斷行為，給她一個警告，使她收斂一些。
公元1881年（即光緒七年）的某一天晚上，慈安太後在自己宮中置辦酒宴，說是為慈禧太後祝福。酒至半酣，慈安太後屏退左右侍從人員，先熱情詳細地追述了在熱河行宮，肅順擅權，兩宮太後受擠，隨後果斷謀劃辛酋政變，以及同治十一年間二人同時垂簾聽政的事情，動情處抽泣垂淚良久。慈禧太後聽了也悲不自勝。慈安見打動慈禧，忽然話題一轉道：“咱們姊妹現在都老了，說不定哪天就要離開塵世。相處20多年，所幸從來都是同心協力，連一句衝撞對方的話都沒說過。而我這裏存有一件東西，是過去從先帝文宗處接受的，現在它已經沒什麼作用了。”說完，慈安太後從袖子裏拿出一個精致的信封遞與慈禧太後，讓她拆開看一下。慈禧太後接過信封，好奇地啟封細看，嚇得臉色頓變，羞慚得不敢抬頭看慈安太後。這封函內裝的不是別的，正是清文宗交給慈安太後的遺詔。遺詔的大意是：葉赫那拉氏是皇帝的親生母親，母以子貴，日後定會尊封為皇太後，我對此人實在是不能深信。此後如果她能安分守法也就罷了，否則，你可以出示這一紙詔書，命廷臣宣布我的遺命，把她除掉。