諾貝爾在他生命的最後幾年，曾先後立下三份內容非常相似的遺囑。第一份立於1889年；第二份立於1893年；第三份則立於1895年，存放在斯德哥爾摩的一家銀行，也就是要以此為準。
早在1889年3月，56歲的諾貝爾在給一位住在斯德哥爾摩的熟人寫的信中說：
請你費心請一位瑞典律師，給我準備一份遺囑的適當格式。我頭發已灰白，身體虛弱，我必須避免死後的糾紛。我早應該準備了，隻是我忙著許多其他的事。
諾貝爾隻是在索要一個樣本，在擬定格式後起草各項條款。然而寄給他的樣本，措辭過於空洞，不合實用。本來諾貝爾經過多次訴訟案件的教訓，對律師已不信任，指責他們是“渺小的寄生蟲”，現在更是對他們失去信心。於是決定由自己擬定。
第一份遺書看來比較簡單，也並未擬完，內容中主要強調了分配一筆基金給斯德哥爾摩大學。
第二份遺書寫於巴黎，時間是1893年3月14日，見證人是湯勞斯頓、諾登費爾特、尼爾生和埃倫伯格。這份遺囑未指出確定款數，隻是列出他財產的一定百分數分給各個人。
這些人是他的朋友和親屬，共有22人之多。他財產的20%是分給他們的。
此外，諾貝爾將一定比例的財產分給下列各社會團體和教育學術研究機構：巴黎的瑞典俱樂部、維也納的奧地利和平朋友協會，為推進和平方案專用；斯德哥爾摩大學管理部門可斟酌支用；斯德哥爾摩醫院、羅琳娜斯卡研究所管理部門決定支用。
諾貝爾還撥出一筆款項給羅琳娜醫學研究院建立一項基金，遵照管理部門的決定，每3年將基金所得利息獎給生理學或醫學領域內最重要和最新的發現或發明。諾貝爾特別指定將他財產的17%分給上述各團體。遺囑中接著寫道：
餘下的財產全部贈與斯德哥爾摩科學院，建立基金，每年由科學院將利息獎給在知識和進步的廣大範圍內，除去生理學和醫學，最重要和最新的發現或才智的成就。
雖然我沒有列出絕對條件，不過我的願望是獎給這樣一些人。他們不論在文字或行動上同一些人或政府堅持反對創建歐洲和平法院的偏見進行鬥爭取得成功。我希望按照我的遺囑考慮獎給最應獲得的人，不管是瑞典人或外國人，是男人或女人。
遺囑又接著說：
我想用一筆巨大款項擴建大城市的火葬場，希望斯德哥爾摩羅琳娜斯卡研究所願意承擔這件事，這是對社會健康和福利有關的重要事情，應熱心完成。
顯然，這份遺囑比後來的一份更有效，因為已指定各受托人。這份遺囑和最後的遺囑有一些差別。在這份遺囑中沒有指定挪威國會或瑞典學士院分配獎金。上列各機構所行使的權力概賦予科學院，至於和平獎可以選定一機構。
這份遺囑中沒有提到文學獎，但這份遺囑說到科學院不僅分配物理學和化學獎，還獎給“在知識和進步的廣大範圍內，除去生理學和醫學，最重要和最新的發現或才智的成就”，這就是說科學院還有權力授獎給文學以及語言學、生物學、數學或在其他方麵做出成就的人。
不十分明確的是諾貝爾想的每年隻頒發一項獎，例如，物理學，還是各科學的幾項獎？前一種情況似乎有較大可能性，即一年頒發物理學獎，第二年頒發化學獎，如此類推。
這兩份遺囑還有一點差別是應該說到的。按照第二份遺囑，和平獎是獎給為創造“和平法院”積極工作的人。而最後的遺囑，受獎人是對國際間的友好、裁減或廢除常備武裝、創立和推進和平會議做出最有成就的工作的人。最後的遺囑沒有提到和平法院，努力創立和平法院的人要在這個法院被肯定有促進國際間友好的趨向後方能獲獎。
1895年11月27日，諾貝爾在巴黎的瑞典俱樂部簽署了他最後的遺囑，見證人是陸軍中尉埃倫伯、法官諾頓費爾特、工程師斯特雷倫納特和瓦斯。這份遺囑對1893年的遺囑做了一些改動，但仍保留主要部分。這份用瑞典文寫成並存放在斯德哥爾摩一家銀行裏的遺囑，於1897年公之於眾。