14.1.2.1.2根據siRNA序列上的能量分布設計siRNA
Chalk A M等通過分析了針對92個基因的398條有效的siRNA氫鍵的能量分布規律，總結出理性設計有效siRNA時的能量特點：總的siRNA雙鏈能量小於1，其中有義鏈5′端結合能在5～9之間，反義鏈5′端的結合能小於9，中間（7～12）的結合能小於13；反義鏈5′端與正義鏈5′端的能量差最好在0～1之間。
14.1.2.2設計抗脫靶的高度特異的siRNA
由於脫靶效應可能產生各種甚至嚴重的後果，所以在RNAi實驗中必須考慮到脫靶效應的影響。理想的方法是通過調節一組參數，係統調查基因組中每一個基因的完全的脫靶效應，但由於費用昂貴不能進行實驗研究，因此促進了In silico研究。這種計算機研究是應用人類、線蟲和酵母（WTBX）pombe基因組和轉錄子序列數據，檢測RNAi的潛在的脫靶效應。研究證明這種RNAi脫靶效應發生幾率值得考慮，因為在來源於代表基因組中所有其他的siRNA和靶向基因編碼序列的dsRNA（範圍是100～400nt）的任何可能的siRNA序列（隨意的長度是17～28nt）中，當應用恰當的參數識別，脫靶效應發生範圍從5％甚至到80％，在線蟲基因密集的區域應用更多單一的序列，使脫靶效應的分布隨染色體而改變。所以，雖然那些隻通過序列識別的，有效的siRNA生物和熱力學的特點能減少大量的潛在的siRNA，但RNAi脫靶效應可能仍然保留，脫靶錯誤發生率為10％。
如何減輕這種脫靶效應？RNAi脫靶效應的發生隨最初dsRNA序列長度的增加而增加（雖然不是很明顯），包含對可利用的未翻譯區域序列的分析和允許siRNA和靶向序列的錯配。體內實驗觀察到21個核苷長度的siRNA是高序列特異性和脫靶反應的低發生率最合適的平衡點。編碼序列的50個Termini的100個核苷的siRNA序列，脫靶反應的發生率低，這是由於基因的信號肽單肽編碼區域的編碼限製與編碼成熟蛋白的區域有關。某些設計軟件如Dharmacon提供了一個輔助設計避免脫靶的策略。這種計算機研究方法有助於在未來的體內實驗中評估活體生物中標化的真實的脫靶率，同樣也有助於討論是否siRNA的效能與靶向分子相關。在果蠅和線蟲的研究中RNAi技術已廣泛應用，但是脫靶效用並不是這些生物的主要障礙。首先，長的dsDNA（不是siRNA）在果蠅和線蟲中有用，這些生物相對哺乳動物不會對dsRNA產生幹擾素反應。其次，存在廣泛的設想，通過Dicer酶產生的大量過量的“好的”和“特異的”siRNA能過度競爭潛在的序列特異的與“差的”和“非特異的”siRNA相關的脫靶效應。雖然生物計算機預測開始關注這方麵的問題，但這種爭論沒有在實驗室研究中檢測。
在果蠅RNAi文庫中心（DRSC）應用高通量的RNAi文庫評估長dsRNA的特異性。在含有30個基因組範圍的文庫中對果蠅RNAi的活性進行了總體的分析。分析明顯地預測包含大於和等於19個核苷的dsRNA能與非目的靶標完美地匹配（在silico中被確認），這是產生脫靶效應的明顯的假陽性錯誤率的重要因素。實驗研究也證實dsRNAs中這樣的序列引起假陽性，能高效敲低交叉雜交轉錄產物。值得注意的一點是這種翻譯的結果是建立在每個基因應用一個單一的dsRNA的基礎上。雖然已考慮到被鑒定的產生假陽性率的所有原因，但建議僅僅通過指引幫助確認來自高通量文庫的高質量的信息以避免脫靶效應。
總而言之，避免脫靶效應都是相對的，不是絕對的，這需要綜合各種考慮因素的影響，上麵提及的Dharmacon的那個軟件就是一個輔助設計避免基因幹擾發生offtarget的一種策略，可以在一定程度避免脫靶的發生。
現在有些設計的工具軟件，他們加入了許多設計上的程序和矩陣，讓設計原則更加合理，如Kim等的研究提示無幹擾素應答的前提下，27nt的siRNA雙鏈實際上能有效地激活RNAi途徑，並且比經典的21mers siRNA更早激活這一途徑。研究數據表明27nt雙鏈是由RNaseⅢ家族成員Dicer酶加工獲得，而且27mer siRNA常常表現出比21mer siRNA更有效的RNA幹擾效果。在這一理論的基礎上，通過建立27mer設計運算法則，相關生物學信息和高質量合成方法，推出了siLentmer siRNA雙鏈合成。siLentmer siRNA雙鏈的特點有：①利用先進的生物信息學對敲除特異性同源序列進行分析，確保特異靶標。②低濃度的有效性，一定程度上避免了高濃度時發生脫靶效應。③HPLC級純化siRNA保證了一致和可靠的結果。所以，確保特異靶標，低濃度的有效性，兩者均有助於減少脫靶效應。
任何減少脫靶效應的工具都隻能相對而言的，利用生物信息學原理進行篩選還是有一定必要的，但是針對具體的靶標來說，很多基因的選擇餘地也不是一致的，應該具體情況具體分析。
14.1.3（KG2）“抗脫靶”siRNA的化學修飾
體內的多種RNA酶能降解siRNA，在人體血清內孵育未經過化學修飾的siRNA，其半衰期隻有6分鍾，因而未經修飾的siRNA穩定性較差，在體內的應用受到了限製；而且未修飾的siRNA與血漿蛋白親和力不夠，不被細胞攝取，不易被組織吸收。理想的siRNA化學修飾方法，首先要求經過修飾後不影響siRNA的基因沉默效應，還需要修飾後siRNA能耐受RNA酶的降解效應，最後還要求經過化學修飾後的siRNA分子的細胞毒性低。研究表明恰當化學修飾的siRNAs穩定性好，能與靶位更有效結合，改善其藥代動力學特性的同時卻不影響其內在效能，同時仍能有效抑製目的基因的表達。所以在不使用病毒等載體進行基因治療時，用於治療的siRNA需要先進行化學修飾。