在RNA幹擾出現以前，研究最熱門的逆基因手段是反義寡核苷酸和目標基因的反義RNA。過去，在開發應用過程中科學家利用各種化學修飾的方法解決了反義寡核苷酸和反義RNA的分子穩定性的各類問題。因此，針對新的逆基因手段RNA幹擾所遇到的同樣的問題，人們借鑒了以往應用於提高反義寡核苷酸和反義RNA分子穩定性的方法來修飾siRNA分子。目前，常用的siRNA的化學修飾主要可分成4類：2′位置的核苷酸戊糖修飾，磷酸骨架鏈修飾和堿基的化學修飾及某些特殊化學修飾。這些化學修飾既能增加siRNA的穩定性，又能維持其基因沉默的效力。
14.1.3.12′位置的核苷酸戊糖修飾
核糖的化學修飾是目前使用較廣泛的siRNA修飾方法，通常修飾的位置為核糖的2′，包括：2′-O-甲基核糖、2′-氟2′-脫氧胞苷酸、2′-脫氧尿苷、2′-O-丙烯基核糖、2′-氟2′-脫氧尿苷等。研究表明，單純對正義鏈或反義鏈或雙鏈的核糖修飾都明顯誘導基因沉默效應，但把所有的核苷酸甲基化或烯丙基化後卻不能在哺乳動物細胞內產生RNA幹擾，甚至siRNA的雙鏈間不能形成配對。隻有在siRNA鏈的部分核苷酸應用甲基化或烯丙基化修飾才能保持siRNA沉默目標基因的功能與分子的穩定性。以下介紹兩種常用且重要的2′位置的核糖修飾。
（1）對核苷酸戊糖2′-羥基（2′-OH）的修飾是siRNA最重要的修飾之一。Chiu和Rana等在HeLa細胞中利用2′-OH修飾的siRNAs研究靶向EGFP基因產生的影響。他們發現siRNA核苷酸的2′-OH不是產生RNAi的必要條件，如果將siRNA上嘧啶核苷酸的2′-OH用2′-F替代既修飾為2′-氟嘧啶，則使RNA酶不易識別siRNA，從而增加了siRNA抗核酶能力，即穩定性提高。同時研究也證實在HeLa細胞中siRNAs反義鏈用2′-氟尿嘧啶和2′-氟胞嘧啶代替2′-OH修飾，還能增強siRNAs在HeLa細胞中的穩定表達，而未影響其沉默效應。血漿試驗證明，2′-F siRNA比2′-OH siRNA能更長時間的穩定存在。因此，在核糖的2′位置引入某些取代基如甲基、氟後，使siRNA具有更強的抵抗核酸酶水解的性能。Chiu YL等的研究顯示誘導RNAi的重要因素是siRNA與mRNA形成的雙鏈結構而不是2′-OH，且雙鏈2′-FsiRNA比修飾或未修飾的單鏈siRNA的穩定性強，作用更持久。
（2）在siRNA核苷酸戊糖的2′位置引入烷基，其中最常用的化學修飾是2′-O-甲基（2′-O-Me）。HeLa細胞中，在正義鏈或反義鏈中用2′-O-Me修飾的siRNA的基因沉默效應明顯降低，而雙鏈均有2′-O-Me修飾的siRNAs能完全消除幹擾效應。一個可能的解釋是甲基團能完全限製siRNA與目標mRNA之間的聯係，消除RNA幹擾效應。前麵也提到，把所有的核苷酸甲基化或烯丙基化後不能在哺乳動物細胞內產生RNA幹擾，甚至siRNA的雙鏈間不能形成配對。因此，全鏈修飾將導致siRNA失去活性，一般僅對雙鏈末端1～4個核苷酸進行修飾。體外試驗證明，5′端和3′端有甲基化核苷酸的siRNA與未經修飾的siRNA基因沉默持續的時間延長，但不抑製基因表達的活性。其中，3′突起端尤其可以耐受各種類型的修飾。但隨著siRNA甲基化核苷酸的數目增多，其RNA幹擾的活性逐漸下降。Jackson等報道了在siRNA seed區域對特異性位置的2′-O-Me能降低脫靶轉錄產物的數量和調節的強度，而不影響目的靶標的沉默效應。但一般來說，修飾的核苷酸不超過4個。
一項合作研究證實siRNA的第2個堿基的核糖基環的2′位置能明顯降低脫靶效應。重要的是，這種共同的寡核苷酸修飾不影響靶基因的沉默程度。雖然在miRNA 3′端附加的結合序列能增加沉默效應的幾率，甚至當與miRNA 5′端並不完全互補時也能增加，但其他的研究顯示在靶標和miRNA2～7/8核苷酸之間的完美的互補足夠影響它自身的調低。有趣的是，當2′-O-Me修飾加在siRNA的2位置而不是1位置時，能更加有效減少脫靶水平。
14.1.3.2磷酸骨骼鏈修飾
磷酸骨骼鏈通過磷酸二酯鍵結構與RNA連接，所以磷酸二酯鍵是核酸酶作用的敏感化學鍵。前幾年研究最多的化學修飾反義寡核苷酸是硫代磷酸酯反義寡核苷酸，是將核酸分子中的各個核苷酸單體內磷酸二酯的遊離氧基用硫離子代替，生成更穩定的核酸骨骼結構，其在生物和化學的穩定性、細胞的攝入、藥代動力學性質及RNase H啟動的mRNA切割機製方麵表現良好的生物活性。在動物疾病模型中，甚至在一些一期的臨床試驗都已經用上了硫代磷酸酯反義核苷酸。因此，在開始siRNA作為治療疾病的新型基因藥物的同時，人們便開始設想采用硫代磷酸酯siRNA。
在siRNA的化學修飾中，硫代磷酸的化學修飾是指用一個硫原子取代磷酸二酯鍵的氧原子，即PS鍵替代PO鍵。硫代磷酸酯siRNA能耐受血清中和細胞液內的RNA酶Ⅲ的降解，穩定性高，沉默目標基因的效能與未經修飾的siRNA分子相似。
（1）硫代磷酸修飾的位置影響RNA幹擾效應。siRNA正義鏈的硫代磷酸修飾對RNA幹擾的活性影響較小；對siRNA反義鏈或雙鏈的硫代磷酸修飾會明顯影響RNAi的活性。
（2）由於具有廣泛PS鍵的寡核苷酸與血清蛋白結合的能力增加，所以能在體內產生毒性，這成為該化學修飾的siRNA推向臨床應用的障礙。例如人角質化細胞中，主鏈修飾沒有降低siRNAs靶向HTF基因的沉默活性，但研究證明相對於模擬轉染的細胞，大部分具有廣泛PS的siRNA具有細胞毒性，引起70%細胞死亡。在小鼠模型中注射硫代磷酸酯siRNA，會引起嚴重的免疫反應和肝毒性，甚至導致小鼠死亡。