14.1siRNA的靶點特異性與脫靶效應
在基因功能的研究方麵，目前應用的方法有反義RNA技術抑製轉錄，核酶技術去除細胞內的mRNA，培養細胞內顯微注射特異性抗體，或者通過特異性的結合抗體同細胞表麵的受體結合以抑製蛋白質的功能，以及RNA幹擾技術（RNAi），從而研究基因功能。其中，RNAi與這些技術相比具有自己獨特的優勢。
RNA幹擾技術是一種新的高效的基因敲除的方法。它是機體基因表達的一種調控方式，屬於轉錄後水平調控方式的一種，它是通過小幹擾RNA（siRNA）特異性的結合並降解一個或多個靶向mRMA而起到抑製基因表達的作用：化學合成的短雙鏈RNA（dsRNA）或者通過載體導入細胞表達的shRNA在內切核酸酶（一種具有RnaseⅢ樣活性的核酸酶，Dicer）作用下加工裂解形成19～23nt的由正義和反義序列組成的幹擾性小雙鏈RNA（dsRNA），即siRNA。由siRNA中的反義鏈指導形成一種核蛋白體，該核蛋白體稱為RNA誘導的沉默複合物（RNAinduced silencing complex，RISC），由RISC介導切割靶mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區域，導致目的mRNA序列部分降解，喪失功能，抑製了其蛋白質的表達，從而達到幹擾基因表達的作用。近幾年來RNAi的研究取得了很大進展，它被《Science》雜誌評為2001年的十大科學成就之一。2002年RNAi的研究又有了新的突破，發現它在基因表達調控中發揮重要作用，這使其名列2002年《Science》雜誌評的十大科學成就之首。因此，在分子生物學領域，RNA幹擾很快被接受為序列特異性的基因沉默的標準方法。
RNA幹擾能產生序列特異性的基因沉默主要在於siRNA具有靶點特異性：①早期的研究已證實siRNA具有高度特異性。siRNA是嚴格按照堿基配對的法則與目標mRNA結合，對互補序列的特異性要求相當高。雖然各處的報道仍有分歧，但很多研究都證實與互補mRNA相差一個堿基序列的siRNA抑製目標基因表達的效能大大下降，而相差兩三個堿基序列的siRNA的作用會完全喪失。例如，應用針對胰腺癌細胞發生了點突變的（WTBX）Kras基因的siRNA，能高效抑製該基因在癌細胞中的過量表達，控製細胞增殖，而對正常細胞中僅相差一個堿基碼的正常（WTBX）Kras基因則無影響。因此，（WTBX）rassiRNA既可以治療腫瘤，又不會影響正常組織細胞的功能。②設計siRNA時需要做詳細的基因序列檢索，以免siRNA與其他不相關的基因互補。這樣一方麵可防止因為非相關基因的抑製而產生的毒性不良反應，另一方麵又不至於因siRNA的攻擊目標被分散而降低其預期的基因抑製效應。所以，RNA幹擾的特異性，不僅是siRNA應用於基因研究時能準確剖析具體基因功能的前提條件，也是用於治療疾病時藥效強大、不良反應小的保障。③與傳統的反義寡核酸技術相比，siRNA靶點位置更具特異性。傳統的反義寡核酸技術是應用反義寡核苷酸類藥物通過WastonCrick堿基配對與細胞內核酸（DNA或RNA）特異結合形成雜交分子，從而在轉錄和翻譯水平抑製特定基因表達的基因治療技術。
其主要機製是反義寡核苷酸與靶mRNA結合形成DNARNA雜合分子，可以激活RNase H酶。該酶可以切割雜合分子中的RNA鏈，導致靶mRNA降解；不能激活RNase H活性的反義寡核苷酸也可以通過空間位阻效應阻止核糖體結合來抑製靶mRNA的翻譯；另外還可以通過封閉剪接位點有選擇地促進蛋白某個可變剪接體的表達，從而糾正錯誤的剪接。從反義寡核酸技術的機製中不難看出，無論是針對目標DNA還是mRNA，反義寡核苷酸的靶點位置常常是調節基因複製，轉錄和翻譯的蛋白因子結合的部位，因此很難與目標序列完全結合，這就影響了它們發揮沉默基因的效應。而siRNA的序列通常設計在基因起始碼下遊10個堿基以後，這些位置既無蛋白結合，也不是複雜的折疊部分，因此容易被整合在RISC中的siRNA結合，所以抑製基因的特異性強得多，基因抑製的效率更是強大數百倍至數千倍。此外，應用DNA質粒或病毒載體表達siRNA能長期穩定地供給細胞siRNA，執行特異性的基因沉默功能。
然而，在RNA幹擾保持如此振奮人心的基因沉沒效應的同時，它的特異性並沒有如最初所期望的一樣保持高效。早期的一些報道如Boutla A等的研究顯示，一些siRNA中心區域的靶區的突變並沒有使敲低效應完全消除，Harborth J等的結果也顯示siRNA對不穩定的堿基對部分耐受。因此，科學家們開始質疑siRNA的特異性。
為了驗證RNAi基因沉默作用的特異性，Jackson等采用基因芯片技術檢測RNAi作用後基因的表達。Jackson等測試了24個作用於2個基因的siRNA，實驗證據顯示在靶基因和siRNA引導鏈之間，含有11個連續核苷酸序列與siRNA相同的非目的基因受RNAi作用的影響，引起轉錄產物的廣泛沉默。Jackson等隨後的包含6個基因的數據序列研究也支持這一結果。Semizarov等用同樣的方法研究發現，當濃度為100nM時，siRNA抑製了非目的基因的特異性沉默，（Lafayette，CO）的文章也證實RNA幹擾容易引起非目的基因的沉默。
這種在選擇某一技術抑製目標基因表達時，發生非目的基因特異性的抑製現象被稱為脫靶效應：①在哺乳動物細胞中，RNAi會引起非目標mRNAs的降解，它發生在siRNA啟動位置的交叉雜交區域，或通過siRNA充當miRNA的角色，引起非相關轉錄產物的翻譯沉默，重要的是在RNA幹擾中，這些效應與非特異性幹擾效應無關，而是由siRNA的序列決定。②一些siRNA能以非序列依賴的方式誘導基因表達的一般的非特異性的改變（如幹擾素反應）。
14.1.1siRNA的脫靶效應
14.1.1.1脫靶效應的機製
通過對非目的轉錄產物的序列分析揭示，這些非目標基因沉默效應與非特異性幹擾效應無關，但明顯由siRNA的序列決定，即相似性序列發生交叉反應而引起脫靶效應。從脫靶效應來看，正義和反義鏈都有可能引起脫靶效應，主要看是哪條鏈產生幹擾作用。脫靶效應可能是獨立於基因沉默效應的，可能是序列依賴性的。由於正義鏈的3′端和反義鏈的5′端對基因沉默的貢獻相對較大，又稱為中心序列。