因此，2′-O-甲基修飾的siRNA，設計為非炎性，在體內顯示了與未修飾的siRNA相同的潛能，但沒有與未修飾siRNA全身應用相關的其他的脫靶效應。這種方法將普遍應用在基因目標的廣泛領域，在治療背景下顯示良好的應用前景。通過阻止幹擾素和細胞因子的誘導作用，能限製基因表達的發生脫靶效應的潛能，同時提高siRNA組成成分的耐受性。
14.1.1.3.3脫靶效應、mRNA結構和蛋白效應
許多的mRNA的變化是由於存在部分互補位置的siRNA引導鏈的相互作用，因此被認為是脫靶效應。所以檢測mRNA對脫靶效應siRNA的相互作用是很重要的，Overhoff M等通過計算機軟件進行mRNA二級結構的預測，並用RNase H mapping對照，發現mRNA二級結構可以幹擾siRNA的作用。如Argonaute 2（AGO2）是AGO家族唯一能催化標準siRNA分裂的蛋白，在轉染了一個不完全互補的siRNA下調AGO2後，並沒有明顯影響mRNA敲低的程度。這些結果提示大部分非靶向mRNA的降低並不依賴降解過程的AGO2。這說明幹擾siRNA的作用可能與mRNA二級結構有關。Luo K Q等建議用氫鍵係數參數來代表mRNA的二級結構，並通過實驗發現siRNA的沉默效率與氫鍵係數成反比關係，沉默效率確實與mRNA二級結構有關係。Schubert S等構建具有二級結構的靶mRNA載體。實驗證明，靶目標區域的二級結構越複雜，siRNA的沉默效率就越低。
部分研究者生產了一係列的mRNA：包含單鏈雙鏈錯配，凸出siRNA，與11非經典的堿基對相互作用，結合位點位於整合報道基因的3′UTR，以及包含9～11位置的錯配siRNA複合體，結果引起接近一半的雙倍的或更多的mRNA降低，並伴有不同程度的蛋白質敲低。然而，各種RNA的mRNA與蛋白質的分析表明：siRNA複合體揭示mRNA和蛋白質水平並不相關。降解產物的分析結果發現mRNA的恢複，與外源性基因的不完全互補的siRNA作用有關，揭示降解產物的小片段與標準的siRNA切割位點map。
14.1.1.3.4RNA幹擾的脫靶效應能誘導樹突棘和突觸收縮
哺乳動物通過細胞中雙鏈DNA的表達RNAi的誘導能激活先天的抗病毒反應途徑，這擾亂脫靶基因的表達。在鼠的海馬錐體神經元的發夾RNAs（shRNAs）的表達有脫靶效應，能減少樹突狀結構的複雜性和觸發樹突棘的丟失。在靜止期膜電位，RNA Morphological的改變伴隨著電生理的混亂，並且有興奮和抑製突觸的數量和長度的減少。這些依賴於shRNA序列的混亂與目標蛋白的鑒別無關。所以，RNAi的脫靶效應會嚴重擾亂神經結構和功能，導致受腦電圖影響的細胞的功能退化。
14.1.2設計高度特異的siRNA
14.1.2.1siRNA的設計
由於不同的siRNA序列沉默基因的效率存在很大的差別，因此siRNA序列的結構是RNAi作用成功與否的關鍵。那麼如何設計siRNA序列的結構呢？2001年，Elbashir S M等應用化學合成的siRNA誘導哺乳動物發生RNAi，並在此基礎上提出了siRNA序列的設計方法可遵循以下的幾個理念：①利用有效的工具軟件，確定所設計的siRNA是否能特異靶向目的基因，這也是目前應用最廣泛最普遍的方法之一；②在基因組中設置無對應序列的siRNA作為對照；③建議從起始密碼下遊50～100nt開始搜索siRNA，就可避免5′或3′端的UTRs的蛋白結合位點的影響，可選擇5′AA（N19）UU序列或5′AA（N21）或5′NA（N21）序列；而且G/C含量盡量控製於30%～80%之間。Elbashir S M的設計理念具有一定的指導意義，但是各種研究結果證明該方法篩選特異性的siRNA效率很低。目前，影響siRNA功能的因素包括很多方麵，如靶mRNA的空間結構、siRNA序列的本身結構特點、siRNA與mRNA錯配、RISC與siRNA的相互作用等。因此，理性設計有效的siRNA就成為實驗成功的一個關鍵因素，成為siRNA研究的一個重要方向。
目前，siRNA的理性設計依據可以歸納為兩方麵：①根據生物信息係統軟件，以有效序列自身的結構特點為依據而建立的設計規律。②根據siRNA序列上的能量分布尤其是氫鍵的能量分布規律而提出的設計方法。
14.1.2.1.1根據有效序列自身的結構特點設計siRNA
Reynolds A通過測定針對2個基因合成的180條siRNA的沉默效率，總結出理性設計有效siRNA的原則：有義鏈15～19位至少有3個腺嘌呤或尿嘧啶，其中有義鏈19位和3位為腺嘌呤（A），10位為尿嘧啶（U），9位非鳥嘌呤（G）或胞嘧啶（C），13位非鳥嘌呤，且GC含量在30%～52%之間；避免出現莖環。在此基礎上Amarzguioui M等研究進一步補充了設計原則：siRNA有義鏈3′端的高A/U，5′端的低A/U，1位的非U，19位的非G，16位的C，能增強沉默效率。這些原則已經被普遍應用於siRNA的序列設計。